根除幽门螺杆菌对慢性萎缩性胃炎组织中生长抑素及其受体的蛋白和mRNA表达的影响

摘要

目的: 分析幽门螺杆菌(H. pylori)感染及根除对慢性萎缩性胃炎(CAG)组织中的生长抑素及其受体蛋白和mRNA表达的影响, 探讨H. pylori的致病机制及其在胃癌发生中的作用.

方法: 采用快速尿素酶试验、Giemsa染色及Warthin-Starry银染色检测H. pylori; 应用免疫组织化学SP法和RT-PCR技术检测56例萎缩性胃炎组织中的生长抑素(somatostatin, SS)及其受体hSSTR2、hSSTR5蛋白和mRNA表达情况, 以及H. pylori根除前后慢性萎缩性胃炎组织中的生长抑素蛋白和mRNA表达的变化.

结果: H. pylori阳性组慢性萎缩性胃炎组织中的SS蛋白和mRNA表达均显著低于H. pylori阴性组(16.00±1.50 vs 21.38±1.38, 0.30±0.05 vs 0.57±0.13, P<0.001), 而H. pylori阳性组萎缩性胃炎组织中的hSSTR2 mRNA和hSSTR5 mRNA表达与H. pylori阴性组比较无明显变化. 经三联治疗根除H. pylori后, 慢性萎缩性胃炎组织中的SS蛋白和mRNA表达较治疗前显著增加(23.16±2.74 vs 17.30±1.67, 0.54±0.11 vs 0.31±0.09, P<0.001), 而H. pylori仍为阳性者, 慢性萎缩性胃炎组织中的SS 蛋白和mRNA表达与治疗前比较则无明显变化.

结论: H. pylori感染可以抑制慢性萎缩性胃炎组织中的生长抑素蛋白和mRNA表达, 及早根除H. pylori, 可以纠正生长抑素基因的异常表达, 这可能是H. pylori感染导致慢性胃炎的重要机制之一.

关键词: 无

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: December 17, 2004
Revised: January 1, 2005
Accepted: January 13, 2005
Published online: March 1, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

幽门螺杆菌(H. pylori)是慢性胃炎的致病因素, 其机制尚不完全清楚. 我们过去的研究发现慢性胃炎与生长抑素(somatostatin, SS)及其受体基因有关[1-2]. 因此, 从胃肠激素基因的角度探讨H. pylori感染与胃癌发生的关系可能具有重要的理论和临床意义. 我们通过给H. pylori感染阳性的慢性萎缩性胃炎患者口服丽珠胃三联药物1 wk, 采用免疫组化染色及RT-PCR等技术研究H. pylori感染对胃黏膜上皮生长抑素及其受体基因蛋白和mRNA表达的影响, 并分析其在胃癌发生中的生物学意义.

1 材料和方法

1.1 材料

收集以上消化道症状为主要表现而在第三军医大学附属西南医院、新桥医院和大坪医院行胃镜检查的慢性萎缩性胃炎患者56例. 胃镜活检均取自胃窦部, 所有病例在接受胃镜检查前均无服用大量糖皮质激素和非甾体消炎药史. 所有病例均经HE染色病理诊断证实. H. pylori检测采用快速尿素酶试验、Giemsa染色及Warthin-Starry银染色. 尿素酶试验均阳性, Giemsa染色和Warthin-Starry银染色两项中至少一项阳性者判为H. pylori感染阳性; 三项检查均为阴性者判为H. pylori感染阴性或H. pylori根除. 对46例H. pylori阳性患者均给予丽珠胃三联片剂(枸橼酸铋钾0.22 g bid, 克拉霉素0.25 g bid, 替硝唑0.5 g bid)治疗1 wk, 治疗前及治疗结束后1 mo接受胃镜检查. 兔抗人生长抑素多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品, 即用型免疫组化试剂盒(Kit 9709)为迈新公司产品. 总RNA提取试剂盒(Tripure^TM Isolation Reagent)为德国Boehringer Mannheim(B. M)公司产品, RT-PCR检测试剂盒(Access RT-PCR system, A1250)为美国Promega公司产品, DNA marker 为上海华美公司产品, SS引物序列: F: 5'GGCTGCGCTGTCCATCGTC 3' R: 5' CAGCCAGCTTTGCGTTCTCG 3' 产物长度285 bp. hSSTR2引物序列: F: 5' ATCTGGGGCTTGGTACACAG 3' R: 5'CTTCTTCCTCTTAGAGGAGC 3' 产物长度148 bp. hSSTR5引物序列: F: 5' GCTCTTGGTGTTCGCGGACGT 3' R: 5'CAGGTTGACGATGTTGACGGTGAAG 3' 产物长度298 bp. 看家基因(GAPDH)引物序列: F: 5' CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA 3' R: 5' TCTAGACGGCAGGTCAGG TCCAC 3' 产物长度598 bp. 所有引物均由上海Sangon 公司合成, PAGE纯化.

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色: 采用SP法, 染色程序按SP法操作常规进行. 抗体以1: 50稀释. 最后常规DAB显色, 苏木素复染、脱水、透明、封固. 以PBS代替一抗为阴性对照, 用已知SS蛋白阳性的正常胃组织为阳性对照. 光镜下观察5个以上高倍视野, 计数500个细胞中SS染色阳性细胞数.

1.2.2 RT-PCR方法: 胃组织总RNA抽提严格按照试剂盒说明书进行, 并行甲醛变性胶电泳, DU640紫外分光光度仪测A值, 以确定完整性及含量. 反应体系如下: 5×Buffer 5 μL、MgSO4 1 μL、dNTP 0.5 μL、Primer mix 1.5 μL、AMV 0.5 μL、Tf1 0.5 μL、模板RNA 1 μL, 加灭菌水至终体积25 μL. 在PCR扩增仪(Perkin Elmer 480)上48℃ 45 min将RNA逆转录成cDNA, 然后94℃预变性2 min, 均扩增35个循环, 反应条件为94℃变性30 s, 58℃(SS退火温度Tm = 55℃)退火40 s, 68℃延伸1 min, 最后68℃延伸7 min. 取5 μL目的基因和5 μL各自相应的GAPDH的PCR产物在15 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳. 电泳结果经Gel Doc 100型成像仪输入电脑, 应用四星SX-100图像分析软件(上海四星生物技术实业有限公司产品), 对条带进行吸光度峰值下面积积分, 各个目的基因与其相应的GAPDH积分之比, 即为该目的基因mRNA相对水平.

统计学处理 全部数据均以mean±SD表示, 组间进行t检验, P<0.05有统计学意义.

2 结果

2.1 H. pylori感染对慢性萎缩性胃炎组织中SS、hSSTR₂和hSSTR₅表达的影响

在56例慢性萎缩性胃炎中, H. pylori阳性者46例, H. pylori阴性者10例, H. pylori阳性组慢性萎缩性胃炎组织中的SS蛋白和mRNA表达均显著低于H. pylori阴性组(P<0.001), 而H. pylori阳性组慢性萎缩性胃炎组织中的hSSTR₂ mRNA和hSSTR₅ mRNA表达与H. pylori阴性组比较无明显变化(表1).

表1 H. pylori感染对慢性萎缩性胃炎组织中SS、hSSTR₂和hSSTR₅表达的影响.

H. pylori	n	SS 蛋白	SS mRNA	hSSTR2 mRNA	hSSTR5 mRNA
阳性	46	16.00±1.50b	0.30±0.05b	0.28±0.10	0.25±0.08
阴性	10	21.38±1.38	0.57±0.13	0.23±0.07	0.27±0.06

^bP<0.001 vs H. pylori阴性组.

2.2 根除H. pylori感染对SS蛋白和mRNA表达的影响

46例H. pylori感染阳性的慢性萎缩性胃炎患者均给予丽珠胃三联片剂(枸橼酸铋钾、克拉霉素、替硝唑)治疗, 失访5例, 41例完成试验, 其中H. pylori根除者33例, H. pylori未被根除者8例. H. pylori根除组慢性萎缩性胃炎组织中的SS蛋白和mRNA表达较治疗前显著增加(P<0.001), 而H. pylori未被根除组慢性萎缩性胃炎组织中的SS蛋白和mRNA表达与治疗前比较无明显变化(表2).

表2 H. pylori根除前后SS蛋白和mRNA表达.

H. pylori	n	SS 蛋白		SS mRNA
		治疗前	治疗后	治疗前	治疗后
根除	33	17.30±1.67	23.16±2.74b	0.31±0.09	0.54±0.11b
未根除	8	15.50±0.76	17.10±1.30	0.34±0.12	0.29±0.04

^bP<0.001 vs治疗前.

3 讨论

慢性萎缩性胃炎是一种发病率最高的胃癌前病变, 其在胃癌的发生、发展过程中起了重要作用. 大量研究表明幽门螺杆菌是慢性胃炎和胃癌的致病因素, 但是其确切的致病机制尚不完全清楚.

生长抑素是一种由胰岛、胃和小肠黏膜的D细胞分泌的多肽类激素, 对胃肠道有广谱的抑制作用. 我们以往的研究发现慢性萎缩性胃炎组织中的SS蛋白和mRNA表达明显低于正常胃黏膜组织, 而其受体hSSTR2 mRNA在慢性萎缩性胃炎组织中的表达明显高于正常胃黏膜组织, 提示慢性萎缩性胃炎与SS及其受体hSSTR2有关[1-2]. H. pylori感染是否通过影响SS及其受体基因的表达导致慢性萎缩性胃炎尚不清楚. 因此, 我们对慢性萎缩性胃炎中H. pylori感染与SS及其受体基因的关系进行了研究. 结果发现, H. pylori阳性组萎缩性胃炎组织中的SS蛋白和mRNA表达均显著低于H. pylori阴性组, 而H. pylori阳性组萎缩性胃炎组织中的hSSTR₂ mRNA和hSSTR₅ mRNA表达与H. pylori阴性组比较无明显变化. H. pylori根除组慢性萎缩性胃炎组织中的SS蛋白和mRNA表达较治疗前显著增加, 而H. pylori未被根除组慢性萎缩性胃炎组织中的SS蛋白和mRNA表达与治疗前比较无明显变化. 表明H. pylori感染可以抑制生长抑素基因的表达, 及早根除H. pylori, 则可以纠正其异常表达. H. pylori有可能通过抑制生长抑素基因表达而参与慢性萎缩性胃炎的发生、发展.

我们以前的研究发现H. pylori根除后, 慢性萎缩性胃炎患者的症状基本消失, 胃镜及病理均证实慢性炎症明显减轻或消失, 而H. pylori未根除者, 其症状及炎症未减轻, 个别患者甚至病情加重[3]. 其他研究结果也表明根除H. pylori 可以阻止或延缓萎缩及肠化生的发生和发展, 从而有利于减少胃癌的发生[4-6].

总之, 我们的研究表明, H. pylori感染可以抑制慢性萎缩性胃炎组织中的生长抑素蛋白和mRNA表达, 这可能是H. pylori感染导致慢性胃炎的重要机制之一. 对H. pylori感染阳性的慢性萎缩性胃炎, 应积极给予抗H. pylori治疗. 及早根除H. pylori可以纠正生长抑素基因的异常表达, 并可以阻止或延缓慢性萎缩性胃炎的发生和发展, 从而降低胃癌发生的危险性.

备注

编辑: 张海宁

参考文献

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2.	唐 卓斌, 刘 为纹. 生长抑素及其受体基因在胃黏膜癌变过程中的表达. 世界华人消化杂志. 2001;9:1453-1455.  [PubMed]  [DOI]

3.	唐 卓斌, 周 子成, 杨 建民, 徐 采朴. 丽珠胃三联治疗幽门螺杆菌相关性胃炎及溃疡病疗效观察. 第三军医大学学报. 2000;22:710-711.  [PubMed]  [DOI]

4.	Goh KL, Parasakthi N, Peh SC, Wong NW, Lo YL, Puthucheary SD. Helicobacter pylori infection and non-ulcer dyspepsia: the effect of treatment with colloidal bismuth subcitrate. Scand J Gastroenterol. 1991;26:1123-1131.  [PubMed]  [DOI]

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