病毒性肝炎 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2004. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2004-01-15; 12(1): 58-61
在线出版日期: 2004-01-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i1.58
应用表达谱芯片技术对乙型肝炎病毒前-S2抗原结合蛋白S2-29反式调节基因的研究
陆荫英, 刘妍, 成军, 梁耀东, 陈天艳, 邵清, 王琳, 张玲霞
陆荫英, 刘妍, 成军, 梁耀东, 陈天艳, 邵清, 王琳, 张玲霞, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
陆荫英, 女, 1973-08-27生, 贵州贵阳人, 汉族, 博士, 2003年军医进修学院毕业, 主治医师. 主要从事肝病的基础研究及临床工作.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689; 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-06-25
修回日期: 2003-07-01
接受日期: 2003-07-16
在线出版日期: 2004-01-15

目的: 应用基因表达谱芯片技术, 研究未知功能的乙型肝炎病毒(HBV)前-S2(preS2)抗原肝细胞结合蛋白基因S2-29过表达, 对HepG2细胞的基因表达的影响.

方法: 应用酵母双杂交技术筛选并验证HBV 前-S2的肝细胞结合蛋白基因. 反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从HepG2细胞中扩增S2-29蛋白编码基因片段, 经测序鉴定后构建表达载体 pcDNA3.1(-)-S2-29, 应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-S2-29转染的人肝母细胞瘤细胞系(HepG2)细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.

结果: 筛选出肝文库中HBV 前-S2结合蛋白S2-29的编码基因, 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定正确. 提取转染细胞的总mRNA并进行逆转录成为cDNA, 进行DNA芯片技术分析. 在1152个基因表达谱的筛选中, 发现有9个基因表达水平显著下调, 包括真核翻译延伸因子2、MAP激酶激活的死亡域、谷胱甘肽过氧化物酶、肌动蛋白、NDRG、Prosaposin、SUMO-1激活酶亚基1、胰岛素受体和1个未知功能蛋白. 1个未知蛋白编码基因的表达上调.

结论: 应用基因表达谱芯片成功筛选了HBV 前-S2结合蛋白S2-29蛋白的反式调节基因, 为进一步阐明S2-29蛋白对细胞表达调控的影响提供了新的依据.

关键词: N/A
引文著录: 陆荫英, 刘妍, 成军, 梁耀东, 陈天艳, 邵清, 王琳, 张玲霞. 应用表达谱芯片技术对乙型肝炎病毒前-S2抗原结合蛋白S2-29反式调节基因的研究. 世界华人消化杂志 2004; 12(1): 58-61
Genes trans-regulated by a novel hepatitis B virus preS2 antigen binding protein S2-29 by cDNA microarray
Yin-Ying Lu, Yan Liu, Jun Cheng, Yao-Dong Ling, Tian-Yan Chen, Qing Shao, Lin Wang, Ling-Xia Zhang
Yin-Ying Lu, Yan Liu, Jun Cheng, Yao-Dong Ling, Tian-Yan Chen, Qing Shao, Lin Wang, Ling-Xia Zhang, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China
Supported by: Grants from National Natural Science Foundation of China,No. C030114020, No. C30070689, and Returned Scholarship of General Logistics Department of PLA, No. 98H038.
Correspondence to: Dr. Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, 302 Hospital of PLA, 100 Xisihuanzhong Road, Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn
Received: June 25, 2003
Revised: July 1, 2003
Accepted: July 16, 2003
Published online: January 15, 2004

AIM: To study the biological functions of a novel hepatitis B virus preS2 antigen binding protein S2-29, and to analyze the gene expression profiles of HepG2 cell transfected with S2-29 gene.

METHODS: S2-29 gene was screened and identified by using yeast two-hybrid system 3 and coimmunoprecipita-tion technique. Full-length encoding frame S2-29 and its amino acid sequences were identified by using bioinformatics method and the recombined eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(-)-S2-29 was constructed and transfected into HepG2 cells. Total mRNA was isolated from the HepG2 cells transfected with pcDNA3.1(-) and pcDNA3.1(-)-S2-29, respectively. cDNA microarray was employed for detecting and analysing of mRNA from the HepG2 cells.

RESULTS: S2-29 cDNA sequence was obtained and identified by yeast two-hybrid screening and the bioinformatics analysis. Among 1 152 genes, there were 10 differences, of which 9 genes were upregulated and 1 gene were downregulated in HepG2 cells transfected with S2-29 protein expression plasmid. These genes differentially down-regulated by S2-29 protein included eukaryotic translation elongation factor 2, MAP-kinase activating death domain, glutathione peroxidase 5, gelsolin-like capping protein (actin filament), NDRG family member 2, prosaposin, SUMO-1 activating enzyme subunit 1, insulin receptor and a novel protein.

CONCLUSION: Microarray technique is successfully used to screen the genes trans-regulated by S2-29, which brings some new clues for studying the trans-regulation and biological function of S2-29.

Key Words: N/A
0 引言

基因表达谱芯片技术(cDNA microarray)是将大量目的基因片段有序、密集地固定于固相载体上而制成, 将两组组织或细胞的mRNA逆转录成cDNA, 掺入荧光标记, 同时与芯片杂交, 通过扫描分析每一位置的荧光信息可以快速有效地检测到二者间差异表达的基因[1-5]. 为从不同角度对HBV 前-S2结合蛋白S2-29的生物学功能进行了解, 探索HBV致肝细胞损伤发生的分子生物学机制, 我们应用基因表达谱芯片技术检测肝癌细胞系在S2-29基因转染后差异表达的基因谱的变化, 有望对这一未知蛋白功能的深入研究提供有价值的线索和依据.

1 材料和方法
1.1 HBV 前-S2肝细胞结合蛋白S2-29的酵母双杂交筛选及鉴定

应用酵母双杂交技术筛选HBV 前-S2核心蛋白结合的肝细胞蛋白的研究原理、方法、操作步骤以及S2-29基因真核表达载体的构建等参考相关的研究论文[6-16].

1.2 细胞培养及转染

在35 mm培养皿中常规培养HepG2细胞, 细胞生长至对数期时, 分别以脂质体转染试剂FuGENE将2g pcDNA3.1(-)-S2-29和空载体pcDNA3.1(-)转染HepG2细胞, 48 h后收获细胞, 每5×106个细胞加入1 mL TRIzol试剂, 立即于液氮中保存.

1.3 总RNA及mRNA的提取和纯化

使用TRIzol试剂一步法提取S2-29蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-S2-29和空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞总RNA(分别标记为实验组和对照组), 样品经分光光度计检测吸光度A值, 并行热稳定实验, 于-20 ℃和70 ℃保温1 h后, 经琼脂糖凝胶电泳检测28 S、18 S条带变化, mRNA主要集中在0.9-4.0 kb间.

1.4 探针标记及芯片制备

逆转录标记cDNA探针并纯化. Cy3-dUTP标记对照组细胞mRNA(5 g), Cy5-dUTP标记实验组细胞mRNA (5 g). 乙醇沉淀后溶解在20 L 5碨SC+0.2% SDS杂交液中. 芯片包含的1 152个cDNA由上海联合基因有限公司提供, 包括原癌基因、抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等. 以通用引物进行PCR扩增, PCR产物长度为1 000-3 000 bp. 靶基因以0.5 g/ L溶解于3×SSC溶液中, 用Cartesian公司的Cartesian 7 500 点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样. 玻片经水合(2 h)、室温干燥(30 min), 紫外线交联, 再分别用0.2% SDS、水及0.2% 的硼氢化钠溶液处理10 min, 晾干备用.

1.5 杂交及洗涤

将预杂交液放入95 ℃水浴锅内变性2 min, 将待预杂交的芯片放入95 ℃水浴锅内变性30 s, 芯片取出后即放入无水乙醇中30 s, 晾干. 将已变性的预杂交液加到芯片的点样区域内, 盖上盖玻片, 放入杂交箱内42 ℃预杂交5-6 h. 将探针置于95 ℃水浴中变性2 min; 芯片置于95 ℃水浴中变性30 s, 芯片取出浸无水乙醇30 s, 探针取出后迅速置于冰上. 将探针置于芯片上, 用盖玻片覆盖, 置于杂交舱中, 用Parafilm密封, 放入42 ℃杂交箱内杂交过夜(16-18 h). 依次以2×SSC+0.2% SDS、0.1×SSC+0.2% SDS、0.1% SSC洗涤10 min, 室温晾干.

1.6 扫描与分析

用General Scanning公司的ScanArray 3 000扫描芯片. 用预先选定的内参照基因(24条管家基因, 每个基因点2个点, 共48个点)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正. 用ImaGene 3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度, 计算Cy5/Cy3比值.阳性结果判断: Cy5/Cy3 >2.0, 红色荧光, 显示表达增强; Cy5/Cy3<0.5, 为绿色荧光, 显示表达减弱.

2 结果
2.1 以HBV 前-S2为"诱饵"对于肝细胞文库酵母双杂交筛选及鉴定结果

以HBV 前-S2为"诱饵"与肝细胞cDNA文库的杂交, 筛选出HBV 前-S2结合蛋白新基因S2-29[17], 并用免疫共沉淀技术再次证实.

2.2 总RNA的定性、定量分析

总RNA的吸光度A260/A280>1.92, 热稳定实验70 ℃保温1 h与-20 ℃ 1 h的电泳条带比较, 显示28 S条带无明显降解, 电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA.

2.3 芯片杂交体系验证及结果分析

在芯片上共有1 152个cDNA. 为了监控芯片杂交体系, 在芯片上设置了阴性对照 (8条水稻基因, 共8个点), 这些点的杂交信号均很低, 证实了数据的可靠性. 由于实验组探针标记Cy5荧光素(呈红色), 对照组探针标记Cy3荧光素(呈绿色), 红绿颜色的差异就显示该基因在实验组和对照组中基因表达水平上的差异, 黄色代表表达水平无差异. 按阳性标准, 从1 152个基因中筛选出差异表达基因共37条, 占3.7%, 其中14条基因表达增强, 23条基因表达降低.

2.4 差异表达基因分析

在差异表达的10个基因中, 有9个基因的表达被下调, 包括与细胞合成代谢、生长分化、凋亡及信号转导相关的一些基因; 1个未知蛋白基因(GenBank号: NM007211)表达被上调, 见表1.

表1 受S2-29影响表达下调的蛋白质编码基因.
编码蛋白质GenBank号
真核翻译延伸因子2001967
MAP激酶激活的死亡域003682
谷胱甘肽过氧化物酶001509
肌动蛋白001747
NDRG016250
Prosaposin002778
SUMO-1激活酶亚基1005500
胰岛素受体000208
未知蛋白AB023160
3 讨论

HBV 前-S2蛋白作为HBV包膜蛋白的组成之一, 功能复杂, 不仅能与PHSA结合介导肝细胞的黏附及入侵, 能引起中和抗体和保护性免疫的发生, 用于构建新型的乙型肝炎疫苗外, 近年来还有报道前-S2蛋白N末端I区可能是截短性中蛋白发挥反式激活作用的重要部分, 可能参与HBV慢性化及HCC的发生过程[18-23]. 为弄清HBV 前-S2蛋白在肝细胞中到底与那些蛋白质因子相互作用、如何作用, 我们应用酵母双杂交技术筛选出了一个与前-S2蛋白有相互作用的新蛋白基因S2-29, 使对前-S2蛋白的研究又有了新的主题.为明确S2-29的生物学功能以及在HBV感染肝细胞过程中所起的作用, 我们应用表达谱芯片技术研究受其过表达影响出现表达异常的基因, 以期能从中寻找到有价值的线索, 为进一步的研究奠定基础.

我们用基因表达谱芯片对新蛋白S2-29作了初步的研究, 构建pcDNA3.1(-)-S2-29真核表达载体, 将空载体作为对照共同转染HepG2细胞, 48 h后提取2组细胞的mRNA进行分析, 发现S2-29的表达能使9种基因表达水平下调, 一种未知功能蛋白基因的表达上调. 下调的基因中包括有丝分裂素激活的蛋白(MAP)激酶激活死亡域(MADD)蛋白, MADD通过自身的C末端区域与肿瘤坏死因子I受体(TNFR1)相互作用, 激活有丝分裂素激活的蛋白激酶, 是TNFR1信号通路复合物中关键的成分. MADD的过表达可激活MAP蛋白激酶细胞外信号调节激酶(ERK), 刺激ERK和c-JUN的N末端激酶-MAP蛋白激酶, 诱导细胞磷脂酶A2的磷酸化. MADD将TNFR1与MAP蛋白激酶的活化与花生四烯酸的释放连接起来[24-28]. Prosaposin是有单拷贝基因编码的一种多功能分泌型的膜蛋白质, 含有4个saposin区域, saposin是一种小的热稳定蛋白, 是特异性的溶酶体水解酶分解鞘磷脂所必需的成分. 存在于多种组织和体液中, 有A、B、C、D四种, 由共同的前体蛋白Prosaposin分解而来, 推测其在体内可能是神经节苷脂的结合和运送蛋白[28-29]. Sentrin-1/SUMO-1是一种小的遍在蛋白类似物, 能够共价结合并修饰一些蛋白质, 包括Ran GTP酶活化蛋白1、IB、PML等, 使这些蛋白改变其亚细胞靶定及稳定性, 从而影响这些因子介导的基因转录[30-31]. N-Myc 下游调节子(NDRG1)在机体中遍在分布, 在细胞生长停止及细胞分化过程中起作用, 可能作为一种信号蛋白穿梭于胞质与胞核间, 在细胞分化过程中被上调, 在胚胎细胞中可以被N-myc、c-myc抑制, 在部分肿瘤细胞中受限制[32-33]. 谷胱甘肽过氧化物酶(GPX5)是氢过氧化物清除系统中的成员, 保护细胞免受脂质过氧化损伤[34]. S2-29能下调上述基因的表达, 提示S2-29可能与细胞信号转导、细胞生长分化及氧化还原过程相关. 另外, 结合临床上HBV感染的患者部分合并有肝源性糖尿病, 在发病机制中胰岛素受体及受体后缺陷是其中关键的因素之一, S2-29能下调胰岛素受体的表达, 且能与HBV前S2蛋白结合, 推测其间的作用可能是肝源性糖尿病发病中重要的一环.

随着越来越多的新基因的发现, 研究新基因及其表达产物的生理、病理学功能已逐渐成为今后科研工作的热点, 但如何从千变万化的蛋白质功能中找出某一新基因的所属, 并明确其具体的一种或多种生物学功能, 是一项艰难而有极具挑战性的工作.利用基因表达谱芯片能进行大规模筛选的优点, 我们从1 152中基因中选出被S2-29影响表达的10条基因, 基于上述结果的提示, 使我们可以设计相应的实验去进行更深入的研究, 为更加全面地了解新基因S2-29的功能作铺垫, 也为更多新基因功能研究工作积累了经验.

编辑: N/A

1.  Zhang MQ. Large-scale gene expression data analysis: a new challenge to computational biologists. Genome Res. 1999;9:681-688.  [PubMed]  [DOI]
2.  Yang GP, Ross DT, Kuang WW, Brown PO, Weigel RJ. Combining SSH and cDNA microarray for rapid identification of differentially expressed genes. Nucleic Acids Res. 1999;27:1517-1523.  [PubMed]  [DOI]
3.  Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, Huard C, Gaasenbeek M, Mesirov JP, Coller H, Loh ML, Downing JR, Caligiuri MA. Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science. 1999;286:531-537.  [PubMed]  [DOI]
4.  刘 妍, 成 军, 王 建军, 杨 倩, 陆 荫英. 基因芯片技术在肝炎病毒研究中的应用. 世界华人消化杂志. 2003;11:461-463.  [PubMed]  [DOI]
5.  刘 妍, 成 军, 李 克, 杨 倩, 陆 荫英, 王 琳, 王 建军. 丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6基因转染肝癌细胞的基因表达谱芯片分析. 世界华人消化杂志. 2003;11:394-398.  [PubMed]  [DOI]
6.  李 克, 王 琳, 成 军, 张 玲霞, 段 惠娟, 陆 荫英, 杨 继珍, 刘 妍, 洪 源, 夏 小兵. 酵母双杂交技术筛选克隆HCV核心蛋白结合蛋白基因1. 世界华人消化杂志. 2001;9:1379-1383.  [PubMed]  [DOI]
7.  陆 荫英, 李 克, 成 军, 王 琳, 刘 妍, 段 惠娟, 张 玲霞. 乙型肝炎病毒X基因酵母表达载体的构建及表达. 世界华人消化杂志. 2002;10:15-18.  [PubMed]  [DOI]
8.  李 克, 王 琳, 成 军, 陆 荫英, 张 玲霞, 李 莉, 刘 妍, 段 惠娟. 丙型肝炎病毒NS2基因酵母双杂交"饵"载体构建及表达. 世界华人消化杂志. 2002;10:129-132.  [PubMed]  [DOI]
9.  王 琳, 李 克, 成 军, 陆 荫英, 王 刚, 刘 妍, 钟 彦伟, 段 惠娟, 洪 源. 筛选与克隆肝再生增强因子结合蛋白的基因. 世界华人消化杂志. 2002;10:161-164.  [PubMed]  [DOI]
10.  陆 荫英, 李 克, 刘 妍, 王 琳, 成 军, 张 玲霞. 乙型及丙型肝炎病毒受体的研究. 世界华人消化杂志. 2002;10:211-213.  [PubMed]  [DOI]
11.  王 琳, 李 克, 成 军, 陆 荫英, 张 健, 洪 源, 刘 妍, 王 刚, 钟 彦伟. 酵母双杂交技术筛选Hcbp6结合的肝细胞蛋白编码基因. 世界华人消化杂志. 2003;11:385-388.  [PubMed]  [DOI]
12.  马 守东, 洪 源, 成 军. 酵母单杂交技术的原理及应用. 世界华人消化杂志. 2003;11:450-451.  [PubMed]  [DOI]
13.  陆 荫英, 王 琳, 成 军, 李 克, 刘 妍, 张 玲霞. 酵母双杂交技术筛选HBcAg肝细胞结合蛋白基因. 世界华人消化杂志. 2003;11:426-429.  [PubMed]  [DOI]
14.  陆 荫英, 王 琳, 李 克, 刘 妍, 成 军, 张 玲霞. HBeAg肝细胞结合蛋白基因的筛选与克隆. 世界华人消化杂志. 2003;11:422-425.  [PubMed]  [DOI]
15.  陆 荫英, 李 克, 成 军, 王 琳, 刘 妍, 张 玲霞. 乙型肝炎病毒前-S1基因酵母表达载体的构建及表达. 解放军医学杂志. 2002;27:341-342.  [PubMed]  [DOI]
16.  陆 荫英, 李 克, 成 军, 王 琳, 刘 妍, 张 玲霞. 乙型肝炎病毒前-S2基因酵母表达载体的构建及表达. 胃肠病学和肝病学杂志. 2002;11:222-224.  [PubMed]  [DOI]
17.  陆 荫英, 李 克, 王 琳, 刘 妍, 王 业东, 成 军, 张 玲霞. 乙型肝炎病毒前S2蛋白结合蛋白基因的筛选. 中华肝脏病杂志. 2003;11:8-11.  [PubMed]  [DOI]
18.  Kondo J, Shimomura H, Fujioka S, Iwasaki Y, Takagi S, Ohnishi Y, Tsuji H, Sakaguchi K, Yamamoto K, Tsuji T. Mutations in the hepatitis B virus Pre-S2 region and abrogated receptor activity for polymerized human albumin. Acta Med Okayama. 2002;56:193-198.  [PubMed]  [DOI]
19.  Deng H, Cheng J, Shi S, Hong Y, Ren X, Li L. A preliminary study on the heterogeneity of Pre-S2 region in hepatitis B virus. Zhonghua Neike Zazhi. 2002;41:233-236.  [PubMed]  [DOI]
20.  Bock CT, Tillmann HL, Manns MP, Trautwein C. The pre-S region determines the intracellular localization and appearance of hepatitis B virus. Hepatology. 1999;30:517-525.  [PubMed]  [DOI]
21.  Park JH, Cho EW, Lee YJ, Shin SY, Kim KL. Determination of the protective effects of neutralizing anti-hepatitis B virus (HBV) immunoglobulins by epitope mapping with recombinant HBV surface-antigen proteins. Microbiol Immunol. 2000;44:703-710.  [PubMed]  [DOI]
22.  Hildt E, Hofschneider PH. The Pre-S2 activators of the hepatitis B virus: activators of tumour promoter pathways. Recent Results Cancer Res. 1998;154:315-329.  [PubMed]  [DOI]
23.  Hildt E, Munz B, Saher G, Reifenberg K, Hofschneider PH. The Pre-S2 activator MHBs(t) of hepatitis B virus activates c-raf-1/Erk2 signaling in transgenic mice. EMBO J. 2002;21:525-535.  [PubMed]  [DOI]
24.  Chow VT, Lim KM, Lim D. The human DENN gene: genomic organization, alternative splicing, and localization to chromosome 11p11.21-p11.22. Genome. 1998;41:543-552.  [PubMed]  [DOI]
25.  Schievella AR, Chen JH, Graham JR, Lin LL. MADD, a novel death domain protein that interacts with the type 1 tumor necrosis factor receptor and activates mitogen-activated protein kinase. J Biol Chem. 1997;272:12069-12075.  [PubMed]  [DOI]
26.  Lim KM, Chow VT. Induction of marked apoptosis in mammalian cancer cell lines by antisense DNA treatment to abolish expression of DENN (differentially expressed in normal and neoplastic cells). Mol Carcinog. 2002;35:110-126.  [PubMed]  [DOI]
27.  Al-Zoubi AM, Efimova EV, Kaithamana S, Martinez O, El-Idrissi Mel-A, Dogan RE, Prabhakar BS. Contrasting effects of IG20 and its splice isoforms, MADD and DENN-SV, on tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis and activation of caspase-8 and -3. J Biol Chem. 2001;276:47202-47211.  [PubMed]  [DOI]
28.  Hazkani-Covo E, Altman N, Horowitz M, Graur D. The evolutionary history of prosaposin: two successive tandem- duplication events gave rise to the four saposin domains in vertebrates. J Mol Evol. 2002;54:30-34.  [PubMed]  [DOI]
29.  Hiraiwa M, Soeda S, Kishimoto Y, O'Brien JS. Binding and transport of gangliosides by prosaposin. Proc Natl Acad Sci USA. 1992;89:11254-11258.  [PubMed]  [DOI]
30.  Desterro JM, Rodriguez MS, Kemp GD, Hay RT. Identification of the enzyme required for activation of the small ubiquitin-like protein SUMO-1. J Biol Chem. 1999;274:10618-10624.  [PubMed]  [DOI]
31.  Okuma T, Honda R, Ichikawa G, Tsumagari N, Yasuda H. In vitro SUMO-1 modification requires two enzymatic steps, E1 and E2. Biochem Biophys Res Commun. 1999;254:693-698.  [PubMed]  [DOI]
32.  Qu X, Zhai Y, Wei H, Zhang C, Xing G, Yu Y, He F. Characterization and expression of three novel differentiation- related genes belong to the human NDRG gene family. Mol Cell Biochem. 2002;229:35-44.  [PubMed]  [DOI]
33.  Ohki T, Hongo S, Nakada N, Maeda A, Takeda M. Inhibition of neurite outgrowth by reduced level of NDRG4 protein in antisense transfected PC12 cells. Brain Res Dev Brain Res. 2002;135:55-63.  [PubMed]  [DOI]
34.  Hall L, Williams K, Perry AC, Frayne J, Jury JA. The majority of human glutathione peroxidase type 5 (GPX5) transcripts are incorrectly spliced: implications for the role of GPX5 in the male reproductive tract. Biochem J. 1998;333:5-9.  [PubMed]  [DOI]