原代肝细胞分离培养技术现状及展望

表1 迄今发展的各种肝细胞分离方法的优缺点对比

分离方法	最适对象	优点	缺点	参考文献
机械分离法	小型动物及肝组织块	操作简单; 不需要复杂仪器和昂贵的胶原酶; 分离得到细胞的膜蛋白的成分和性质不易发生改变	所得细胞的收获量和成活率很低	[3], [4]
胰酶消化法		操作简单; 酶价格便宜	胰酶易造成肝细胞死亡, 使细胞活率低	[17], [18]
胶原酶消化法	肝脏体积小的动物	操作简单; 细胞产率高、损伤小, 且细胞维持特异功能时间较长	胶原酶价格昂贵; 获得的肝细胞悬液多细胞团块存在	[7], [18]
离体胶原酶灌流法		该法具有较好的细胞收率	需要较高的操作水平; 需要摸索最适酶浓度和作用时间; 所得细胞活率低	[9], [19]
半原位胶原酶灌流法	适用于大规模的肝细胞分离	不需要特殊设备; 半原位灌注使胶原酶的用量仅为原位灌注的1/4	操作技巧要求高; 易发生污染; 细胞易发生灌注再损伤而具有较低的生存能力	[14], [18]
Seglen两步灌流法	主要适用于中等大小动物	所得肝细胞较纯, 细胞存活率高; 可分离肝实质细胞及肝非实质细胞	操作过程复杂, 影响因素多, 细胞易污染; 需要恒流灌注装置, 胶原酶消耗量大	[18], [20], [21]
下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法		灌注效率高, 细胞收率高; 分离得到的细胞纯度高、生存能力强; 节省胶原酶; 细胞不易发生污染	该方法要求较高的操作技巧	[9], [22]
Gerlach五步胶原酶灌流法	主要用于大规模肝细胞分离	分离效率高, 所得细胞纯度高; 灌注的同时分离肝脏, 可避免污染; 所得细胞具有较强的生存能力和分化特性	操作过程复杂; 该方法的分离效果易受到不同的胶原酶浓度、动物体质量和月龄的影响	[16]

表2 各种肝细胞培养方法的优缺点对比

培养方法	最适对象	优点	缺点	参考文献
组织块贴壁培养法		操作简便, 流程短, 成本低	所培养的细胞数量有限、且细胞成分不纯; 细胞生长状态较差	[6]
肝细胞-非实质细胞混合培养法		细胞具有良好的生长状态和分化特性; 提高培养细胞的密度	需较高的细胞分离技术; 培养条件要求高	[26], [46]
单层胶原培养法		操作简单; 细胞能在较长时间内维持正常形态和生理功能, 有一定的增殖能力.	不能用于大规模细胞培养; 易使肝细胞失去分化表型	[47], [48], [49]
双层胶夹层培养法		细胞生长状态好; 良好微环境有助于维持肝细胞功能和分化特性	需要昂贵的胶原; 需要较高的技术支持	[50], [51]
微载体黏附培养法	动物细胞和人肝细胞系	具有相对较大培养空间; 培养环境均一, 避免发生接触抑制; 实现细胞可控生长; 细胞易于黏附, 生长状态好; 培养可自动化	细胞易失去正常形态和分化功能; 剪切力、营养供给等因素会影响细胞生存和分化; 存在使用安全性问题	[30], [31], [32], [33], [49], [52]
微囊培养法		培养的细胞具良好代谢活性; 能为细胞提供适宜的微环境; 细胞存活率高; 培养的细胞可用于异种移植	存在生物相容性问题; 细胞培养的效果受多种因素制约, 稳定性差	[34], [35], [53]
球形聚集体培养法	适用于原代细胞培养	设备简单, 节省经费; 培养的细胞具有良好的生长状态和分化特性; 不需特殊载体; 实现了高密度细胞培养	需纯度较高的细胞来源; 需较高操作水平	[36], [38], [54]
微流体通道培养法	适用于微量原代细胞培养	所需细胞数量和试剂量少; 能维持细胞良好的生长和分化状态; 细胞能维持特异性表型	需特殊技术、花费大; 细胞生长速率慢、易感性低; 不能进行大规模细胞培养	[39]
生物反应器培养系统	大规模细胞培养	可进行大规模细胞培养; 可避免异种细胞产物抑制细胞的生长、分化; 细胞生长状态好	需高的技术和经济支持; 细胞活力低; 肝细胞功能难以长期维持	[40], [41], [42], [44], [45], [55],