控急性胰腺炎患者外周血CD14+CD16+单核细胞表达B7-H2的临床意义

摘要

背景

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是常见的急腹症, 不同类型预后不同. AP的免疫应答和失衡免疫与其严重程度有关, 炎症因子和相关免疫细胞在AP发病机制中至关重要, 因而寻找炎症细胞和新炎症免疫因子对精准治疗AP具有重要意义.

目的

探讨AP患者外周血CD14⁺CD16⁺单核细胞表达B7-H2的临床意义.

方法

AP患者63例[轻度AP(mild AP, MAP)25例、中度AP(moderately severe AP, MSAP)20例、重度AP(severe AP, SAP)18例], 对照组为健康体检者20例, 采用流式细胞仪检测CD14⁺CD16⁺细胞亚群上B7-H2表达情况, 评价其与胰腺炎严重程度关联性及临床意义.

结果

AP患者发病24 h CD14⁺CD16⁺细胞B7-H2出现异常高表达, 显著高于健康对照组(t = 11.10, P<0.001); AP各组B7-H2在CD14⁺CD16⁺细胞膜上表达明显高于CD14⁺CD16^-细胞膜上表达(P<0.01); SAP组CD14⁺CD16⁺和CD14⁺CD16^-细胞B7-H2表达(373.30±89.72和78.62±13.05)最高, MSAP组(279.55±76.95/44.92±12.44)其次, 均高于MAP组(181.15±35.75/23.32±4.28), 各组两两比较差异有显著性(P<0.01); MAP组、MSAP组发病24 h、48 h、72 h CD14⁺CD16⁺和CD14⁺CD16^-单核细胞膜B7-H2动态表达差异无显著性(P>0.05), 然而, SAP组无论CD14⁺CD16⁺还是CD14⁺CD16^-细胞膜B7-H2表达24 h、48 h、72 h均呈明显上升趋势, 差异有显著性(P<0.05).

结论

CD14⁺CD16⁺和CD14⁺CD16^-单核细胞膜B7-H2在AP患者体内高表达, 与AP严重程度密切相关, 且SAP呈动态升高变化; 同时B7-H2在AP患者CD14⁺CD16⁺单核细胞膜表达较CD14⁺CD16^-单核细胞明显升高, 为进一步认识AP免疫应答和失衡提供了新的线索, 为AP精准靶向治疗提供参考.

关键词: 急性胰腺炎; CD14⁺CD16⁺单核细胞; CD14⁺CD16^-单核细胞; B7-H2

核心提要: 本研究采用流式细胞仪检测CD14⁺CD16⁺细胞亚群上B7-H2表达情况, 分析其与急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)严重程度的关联性, 初步验证了严重AP中B7-H2的高表达, 为寻找AP新免疫因子及揭示靶向治疗方法奠定理论基础.

Clinical significance of B7-H2 expression in peripheral blood CD14⁺CD16⁺ monocytes in patients with acute pancreatitis

Ju Gong, Jian Huang, Ruo-Xin Xu, Yun Wu, Yi-Wu Man, Wei Chen, Zhao-Fang Tang, Ping Le

Ju Gong, Jian Huang, Ruo-Xin Xu, Yun Wu, Wei Chen, Zhao-Fang Tang, Ping Le, Department of Emergency Medicine, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China

Ju Gong, Department of Critical Care Medicine, The Affiliated Changshu Hospital of Xuzhou Medical University, Changshu 215500, Jiangsu Province, China

Yi-Wu Man, Department of Emergency Medicine, Shiqian County Hospital of Guizhou Province, Tongren 555100, Guizhou Province, China

Supported by: Science and Technology Program of Suzhou City, No. SYS201537, No. SYSD2015051, and No. KJXW2017064; Science and Technology Program of Tongren City, No. Tong Ren Ke Yan 2018-1-5; Soochow University Project, No. P112200519 and No. P112200719.

Corresponding author: Jian Huang, Chief Physician, Department of Emergency Medicine, the First Affiliated Hospital of Soochow University, 188 Shizi Street, Gusu District, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China. huangjian1997@163.com

Received: December 11, 2019
Revised: January 6, 2020
Accepted: February 20, 2020
Published online: February 28, 2020

Abstract

BACKGROUND

Acute pancreatitis (AP) is a common acute abdominal disease, and different types of AP have a different prognosis. The immune response and imbalanced immunity in AP patients are related to its severity. Inflammatory factors and related immune cells are of great importance in the pathogenesis of AP. Therefore, finding inflammatory cells and new inflammatory immune factors is of great significance for accurate treatment of AP.

AIM

To explore the clinical significance of CD14⁺CD16⁺ monocytes expressing B7-H2 in peripheral blood of patients with AP.

METHODS

A total of 63 patients with AP were enrolled in the study group, including 25 mild AP (MAP) cases, 20 moderately severe AP (MSAP) cases, and 18 severe AP (SAP) cases. Twenty healthy subjects were included as a control group. Flow cytometry was used for detection of B7-H2 expression on CD14⁺CD16⁺ cell subsets to evaluate its relevance to the severity of pancreatitis and clinical significance.

RESULTS

At 24 h after disease onset in patients with AP, CD14⁺CD16⁺cells expressing B7-H2 experienced abnormally high expression, which was significantly higher than that of the control group (t = 11.10, P < 0.001). B7-H2 expression on CD14⁺CD16⁺ cell membrane in each group of AP patients was significantly higher than that on CD14⁺CD16^- cell membrane(P < 0.01); B7-H2 expression on CD14⁺CD16⁺ and CD14⁺CD16^- cells (373.30 ± 89.72 and 78.62 ± 13.05) in the SAP group was the highest, followed by that in the MSAP group (279.55 ± 76.95 and 44.92 ± 12.44) and the MAP group (181.15 ± 35.75 and 23.32 ± 4.28), and the difference between any two of the three groups was significant (P < 0.01). At 24 h, 48 h, and 72 h after disease onset in the MAP group and MSAP group, there was no significant difference in B7-H2 expression on CD14⁺CD16⁺ and CD14⁺CD16^- monocyte membrane (P > 0.05). However, B7-H2 expression on CD7⁺CD16⁺ or CD14⁺CD16^- cell membrane in the SAP group at 24 h, 48 h, and 72 h showed a clear upward trend, and the difference was significant (P < 0.05).

CONCLUSION

B7-H2 is highly expressed on CD14⁺CD16⁺ and CD14⁺CD16^- monocyte membrane in patients with AP, which is closely related to the severity of AP. B7-H2 expression on CD14⁺CD16⁺ monocyte membrane in patients with AP is significantly increased compared with that on CD14⁺CD16^- monocytes, providing new clues for further recognition of immune response and imbalance in AP and for accurate targeted therapy of AP.

Key Words: Acute pancreatitis; CD14⁺CD16⁺ monocytes; CD14⁺CD16^- monocytes; B7-H2

0 引言

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是一种急诊常见的急腹症, 近年来, 不健康的饮食和生活习惯, 使得AP发病率呈逐年上升, 严重危害广大人民群众生命健康. 目前AP根据临床指征[1,2], 可分三种类型: 轻度急性胰腺炎(mild acute pancreatitis, MAP)、中度急性胰腺炎(moderately severe acute pancreatitis, MSAP)以及重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP), 三类AP预后各不相同, 治疗方案也有较大差异. MAP具有自限性, 预后好; 然而, SAP进展迅速, 死亡率高, 需及时收住ICU治疗, 通过加强护理、脏器功能支持、液体复苏以及消化道黏膜屏障保护等措施积极治疗, 方能提高生存率; 因此, SAP临床特征的早期识别, 尤为重要. 现认为AP发病机制主要涉及胰酶激活、炎症反应、免疫失衡、微循环障碍等多方面, 其中免疫炎症因子和相关免疫细胞至关重要, 由此, 炎症细胞和新炎症免疫因子检测在AP鉴别诊断中呈现较高临床价值.

本研究将以CD14和CD16两个分子标记的外周血单核细胞分为两个主要的亚群: CD14⁺CD16⁺单核细胞以及CD14⁺CD16^-单核细胞, 且两者在生物学功能方面具有较大的差异[3]. CD14⁺CD16⁺单核细胞成熟度较高, 且具有较强的抗原递呈能力, 在炎症性疾病中通常升高, 曾作为新生儿败血症的诊断指标[4]. B7-H2是新型共刺激分子, 在免疫调节中发挥重要功能, 然而该分子在CD14⁺CD16⁺单核细胞表达情况尚未见报道. 本文旨在探讨新型共刺激分子B7-H2在AP患者外周血CD14⁺CD16⁺单核细胞表达特征和临床意义.

1 材料和方法

1.1 材料

经苏州大学附属第一院伦理委员会知情同意, 依据2013年中国急性胰腺炎诊治指南[1], 选择苏州大学附一院急诊住院2016-01/2017-12发病24 h内的AP患者63例, 52.60岁±12.21岁, 男37人, 女26人. 其中MAP患者25例(52.24岁±12.34岁; 男14人, 女11人); MSAP患者为20例(52.61岁±13.45岁; 男12人, 女8人); 以及SAP患者为18例(53.11岁±11.25岁; 男11人, 女7人). 按病因分类, 包括胆源性胰腺炎患者29例(MAP, MSAP以及SAP分别为12例, 9例以及8例); 酒精性胰腺炎11例(MAP, MSAP以及SAP分别为5例, 4例以及2例); 高脂性患者9例(MAP, MSAP以及SAP分别为3例, 3例以及3例); 暴饮暴食患者7例(MAP, MSAP以及SAP分别为2例, 2例以及3例)以及其他类型患者7例(MAP, MSAP以及SAP分别为3例, 2例以及2例). 同时, 收集健康体检者20例作为对照组, 年龄范围为51.3±14.2岁, 其中男性11例, 女性9例. 所有受试者均除外传染病、肿瘤、自身免疫病、血液病等疾病. 本研究通过本院伦理委员会批准[2017伦审(申报)批第0056号], 并且所有研究对象均签署知情同意书.

1.2 方法

1.2.1标本收集与处理: 分别于发病24 h、48 h以及72 h收集AP患者外周静脉血, 并以苏州大学附属第一医院体检中心健康人群外周静脉全血作为对照组(healthy control, HC). 采集标本均室温保存, 并在6 h内开始检测.

1.2.2 流式检测: 仪器与材料: CytomicsTM FC 500流式细胞仪(德国); 抗体来自Biolegend公司(美国). 检测方法: 静脉外周血标本与anti-CD14抗体(PC5标记)、anti-CD16抗体(FITC标记)联合B7-H2抗体(PE标记)或同型对照(PE标记), 冰上孵育反应30 min后, 加入红细胞裂解液(Biolegend, 美国)1ml, 37 ℃温育震荡反应5-10 min至反应体系清澈透明; 加入2 mL PBS充分洗涤, 去除细胞碎片以及未结合的游离抗体; 以CD14⁺CD16⁺组合圈门, 检测分析CD14⁺CD16⁺细胞亚群上B7-H2表达情况. 所购抗体均来自Biolegend公司(美国).

统计学处理 计量资料均进行正态分布检验, 以mean±SD表示; 两组均数比较采用完全随机设计t检验; 多组均数比较采用one-way ANOVA及LSD t检验; P<0.05为有统计学意义, 所有检验均为双侧, 统计软件为IBM SPSS Statistics 21.

2 结果

2.1 AP患者CD14⁺CD16⁺细胞膜B7-H2的表达

健康组CD14⁺CD16⁺细胞膜B7-H2几乎不表达, AP组发病24 h CD14⁺CD16⁺细胞膜B7-H2出现异常高表达(P<0.001); 流式检测AP和健康对照外周血CD14⁺CD16⁺细胞膜上B7-H2表达情况, AP患者(n = 63)以及健康对照(n = 20)外周血CD14⁺CD16⁺细胞膜上B7-H2水平统计图, 每一个dot代表一个case, 数据表示为Mean±SE, 统计学方法为unpaired t test. AP患者组以及健康组对比(267.29±104.02, 8.06±3.60; t = 11.10, P<0.001)(图1).

图1 急性胰腺炎和健康组外周血CD14⁺CD16⁺细胞膜上B7-H2表达分析. AP: 急性胰腺炎; HC: 健康组.

2.2 CD14⁺CD16⁺和CD14⁺CD16^-细胞膜B7-H2在不同程度AP患者中的表达

分析发现, SAP组CD14⁺CD16⁺和CD14⁺CD16^-细胞mB7-H2表达(373.30±89.72和78.62±13.05)最高, MSAP组(279.55±76.95/44.92±12.44)其次, 均高于MAP组(181.15±35.75/23.32±4.28), 各组两两比较差异有显著性(P<0.01)(表1、表2), 并且发现AP各组mB7-H2在CD14⁺CD16⁺细胞膜上表达明显高于CD14⁺CD16^-细胞膜上表达(P<0.01).

表1 不同时间点急性胰腺炎各组外周血CD14⁺CD16⁺细胞膜B7-H2值的比较.

组别	n	CD14+CD16+ mB7-H2
		24 h	48 h	72 h
MAP	25	181.15±35.75	185.20±40.61	209.68±62.71
MSAP	20	279.55±76.95	271.20±80.94	277.39±76.60
SAP	18	373.30±89.72	480.49±103.85	641.01±137.00

MAP: 轻度急性胰腺炎; MSAP: 中度急性胰腺炎; SAP: 重度急性胰腺炎.

表2 不同时间点急性胰腺炎各组外周血CD14⁺CD16^-细胞膜B7-H2值的比较.

组别	n	CD14+CD16- mB7-H2
		24 h	48 h	72 h
MAP	25	23.32±4.28	24.23±5.42	24.53±5.86
MSAP	20	44.92±12.44	46.53±9.53	47.10±13.39
SAP	18	78.62±13.05	90.07±12.24	119.41±15.31

MAP: 轻度急性胰腺炎; MSAP: 中度急性胰腺炎; SAP: 重度急性胰腺炎.

2.3 不同时间点AP患者血清中B7-H2的差异表达

MAP组、MSAP组发病24 h、48 h、72 h CD14⁺CD16⁺和CD14⁺CD16^-单核细胞膜B7-H2动态表达差异无显著性(P>0.05); 然而, SAP组无论CD14⁺CD16⁺还是CD14⁺CD16^-细胞膜B7-H2表达24 h、48 h、72 h均呈明显上升趋势, CD14⁺CD16⁺细胞膜B7-H2在不同时间点表达结果分别为373.30±89.72、480.49±103.85、641.01±137.00(P<0.05), CD14⁺CD16^-细胞膜B7-H2分别为78.62±13.05、90.07±12.24、119.41±15.31(P<0.05).

3 讨论

AP发病机制尚不十分明确. 研究显示, 其发病始于胰腺损伤胰酶激活, 继发炎症反应, 从局部适度炎症因子释放, 机体保护性反应, 演变为失控炎症细胞激活连锁反应, 炎症介质"呈瀑布样"释放, 导致全身炎症反应综合征(systemic inflammation response syndrome, SIRS), 机体损害, 最终免疫功能紊乱以及代偿性抗炎反应综合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome, CARS), 引发多器官功能障碍, 为AP死亡的主要原因. 当SIRS和CARS同时并存又相互加强, 则产生对机体更严重的损伤, 导致炎症反应和免疫功能更严重障碍, 称为混合型抗炎反应综合征[5]. 因此, 炎症细胞与炎症因子所诱导的免疫功能紊乱失衡, 直接与AP严重程度相关联, 决定患者预后[6].

单核细胞是一群可塑性极强的髓源性细胞, 在不同病理条件下可以分化为不同的亚群. CD14⁺CD16⁺单核细胞群体是一群新鉴定的单核细胞亚群[3]. 该群细胞主要表现为在炎症刺激下可以释放当量的肿瘤坏死因子-α, 而较少产生白介素-10, 因此该群细胞被称为促炎反应性单核细胞[4]. 既往研究中发现[7,8], 该群细胞在感染和炎性疾病中均大量增加, 并且发挥着重要的生物学功能.

共刺激分子是一群重要的免疫调节分子, 主要表达在树突细胞、B细胞以及单核巨噬细胞等抗原递呈细胞上, 其相应的受体集中表达于T淋巴细胞. 共刺激分子作为第二信号, 在介导抗原递呈细胞刺激T细胞免疫应答中发挥着关键的作用, 其直接决定了免疫应答的方向和强度. B7-H2是共刺激分子家族新成员[9], 其与配体GL50结合在介导免疫应答中发挥着重要作用, 特别是在炎性疾病中. 然而, 该分子在CD14⁺CD16⁺单核细胞上的表达特征并不清楚. 本论文以急性胰腺炎患者为研究对象, 通过比较分析, 发现B7-H2在CD14⁺CD16⁺单核表达强度与AP疾病进展和分型相关.

关于B7-H2在急性胰腺炎患者体内的表达, 本研究团队曾率先报道[10]sB7-H2在AP患者血清中表达量明显增加, 且与AP的严重程度呈正相关, 由此推测B7-H2可能参与AP的发生发展. 为证实此推论, 本研究团队进一步检测AP患者外周静脉血CD14⁺CD16⁺和CD14⁺CD16^-单核细胞膜B7-H2表达, 结果显示AP发病24 h CD14⁺CD16⁺和CD14⁺CD16^-单核细胞膜B7-H2 表达明显升高, 健康组几乎不表达; CD14⁺CD16⁺和CD14⁺CD16^-细胞mB7-H2表达, SAP组表达最高, 其次MSAP组, 均高于MAP组; 动态观察24 h、48 h、72 h B7-H2表达, , MAP组、MSAP组发病无显著差异, 而SAP组呈明显上升趋势; 由此, 可以看出CD14⁺CD16⁺和CD14⁺CD16^-单核细胞膜B7-H2表达, 不仅和炎症相关, 而且和AP早期严重程度密切相关, 与较前研究[10]相一致, 特别是SAP患者B7-H2异常动态增高, 可能预示全身炎症反应SIRS加重, 炎症因子瀑布样释放, 导致免疫紊乱. AP各组B7-H2在CD14⁺CD16⁺细胞膜上表达均高于CD14⁺CD16^-细胞膜, 说明CD14⁺CD16⁺细胞在AP发病过程中更为活跃[7,8].

综上所述, 本研究结果显示, B7-H2分子在AP患者CD14⁺CD16⁺和CD14⁺CD16^-单核细胞膜上呈高表达, 并且与AP严重程度和进展相关, 其在CD14⁺CD16⁺细胞表面表达更为活跃. 但关于其具体调节机制仍需进一步探索, 可为进一步认识AP免疫应答和失衡提供新线索, 为AP精准靶向治疗提供参考.

文章亮点

实验背景

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)发病率逐年升高, 不同分型预后不同, 严重患者死亡率很高. 目前AP发病机制尚未完全阐明, B7-H2是新型共刺激分子, 在免疫调节中起重要作用, 本研究试图寻找B7-H2在AP发生及发展中的异常表达, 揭示其潜在作用机制, 为临床研发治疗药物或制定治疗方案提供依据.

实验动机

本研究主题是揭示新型共刺激分子B7-H2在AP患者单核细胞CD14⁺CD16⁺上的表达差异. 拟解决的问题是揭示B7-H2与AP发生及发展的关系, 为进一步阐明AP免疫应答和炎症反应致病机制提供新方向. 为AP精准治疗寻找新靶点提供理论依据.

实验目标

本研究主要目标是揭示在单核细胞表面表达的膜性B7-H2信号潜在的诱导细胞免疫的机制. 为下一步研究其与预后相关性, 以及动物实验奠定基础. 为临床提高AP治疗效果提供参考.

实验方法

本研究收集AP患者外周静脉血, 利用流式检测方法, 检测分析单核细胞CD14⁺CD16⁺、CD14⁺CD16^-细胞亚群上B7-H2的表达情况. 首次验证了新型共刺激分子B7-H2在单核细胞CD14⁺CD16⁺表面的表达.

实验结果

本研究证实AP患者单核细胞CD14⁺CD16⁺表面B7-H2的表达升高; 重度AP患者CD14⁺CD16⁺、CD14⁺CD16^-表面B7-H2的表达较中度AP、轻度AP更高, 并且72 h内, 表达进行性升高.

实验结论

本研究在B7-H2在免疫应答中发挥重要作用的基础上, 首次验证了其在AP患者CD14⁺CD16⁺、CD14⁺CD16^-单核细胞上的高表达; 首次提出了该新型共刺激分子在AP患者发病机制、免疫调节中的作用假设; 为B7-H2与AP致病机制的细胞学基础提供新理论; 为AP精准靶向治疗提供新依据.

展望前景

该研究需使用新鲜血标本, 以避免影响细胞表面分子和抗体的结合; 未来新型共刺激分子B7-H2有望成为治疗的新靶点; 但需进一步实验验证.

备注

学科分类: 胃肠病学和肝病学

手稿来源地: 江苏省

同行评议报告分类

A级 (优秀): 0

B级 (非常好): B

C级 (良好): C, C

D级 (一般): 0

E级 (差): 0

编辑:王禹乔 电编:刘继红

参考文献

1.	中华医学会消化病学分会胰腺疾病学组; 中华胰腺病杂志编辑委员会, 中华消化杂志编辑委员会. 中国急性胰腺炎诊治指南(2013年, 上海). 中华消化杂志. 2013;33:217-222.  [PubMed]  [DOI]

2.

Banks PA, Bollen TL, Dervenis C, Gooszen HG, Johnson CD, Sarr MG, Tsiotos GG, Vege SS; Acute Pancreatitis Classification Working Group. Classification of acute pancreatitis--2012: revision of the Atlanta classification and definitions by international consensus. Gut. 2013;62:102-111.  [PubMed]  [DOI]

3.	Qiu G, Zheng G, Ge M, Huang L, Tong H, Chen P, Lai D, Hu Y, Cheng B, Shu Q, Xu J. Adipose-derived mesenchymal stem cells modulate CD14++CD16+ expression on monocytes from sepsis patients in vitro via prostaglandin E2. Stem Cell Res Ther. 2017;8:97.  [PubMed]  [DOI]

4.	Boeddha NP, Kerklaan D, Dunbar A, van Puffelen E, Nagtzaam NMA, Vanhorebeek I, Van den Berghe G, Hazelzet JA, Joosten KF, Verbruggen SC, Dik WA, Driessen GJ. HLA-DR Expression on Monocyte Subsets in Critically Ill Children. Pediatr Infect Dis J. 2018;37:1034-1040.  [PubMed]  [DOI]

5.	Keel M, Trentz O. Pathophysiology of polytrauma. Injury. 2005;36:691-709.  [PubMed]  [DOI]

6.	孙 正杰, 黄 坚, 武 正旺, 吴 文庆, 沈 佳庆, 张 光波. 急性胰腺炎患者外周血髓源性抑制细胞表达膜型B7H3的临床意义. 中华急诊医学杂志. 2017;11:1290-1295.  [PubMed]  [DOI]

7.

Regöly-Mérei J, Kovács GC, Orgován G, Irtó I, Fent J, Horkay B, Lakatos Z, Nagy-Dani E, Németh K, Papp G, Schweitzer K, Veszely G, Fürész J. [Role of the monocye-lymphocye system and of endogenous mediators in the severity of acute pancreatitis and in development of its septic complications]. Magy Seb. 2001;54:273-281.  [PubMed]  [DOI]

8.	Rahman SH, Salter G, Holmfield JH, Larvin M, McMahon MJ. Soluble CD14 receptor expression and monocyte heterogeneity but not the C-260T CD14 genotype are associated with severe acute pancreatitis. Crit Care Med. 2004;32:2457-2463.  [PubMed]  [DOI]

9.	Nagamatsu T, Barrier BF, Schust DJ. The regulation of T-cell cytokine production by ICOS-B7H2 interactions at the human fetomaternal interface. Immunol Cell Biol. 2011;89:417-425.  [PubMed]  [DOI]

10.	Huang J, Wu Z, Lu S, Shen J, Kong X, Shen Y. Soluble B7-H2 as a novel marker in early evaluation of the severity of acute pancreatitis. Lab Med. 2015;46:109-117.  [PubMed]  [DOI]