修回日期: 2008-03-05
接受日期: 2008-04-11
在线出版日期: 2008-04-18
1988-09/2007-10我院共收治胆道复杂疑难结石患者98例(其中男42例, 女56例), 均手术后胆道放置T管等引流管. 术后胆道造影发现266胆管内嵌顿结石, 用PSWL和胆道镜碎石, PSWL所用电伏为2.5-3 kV, 能量输出为2-3 J. 击碎的结石用胆道镜取出, 并观察碎石的安全性和效果. 本文就结合自己的临床体会, 观察并比较对胆道复杂疑难结石不同非手术方法治疗的效果.
引文著录: 徐智. 胆道复杂疑难结石的非手术治疗. 世界华人消化杂志 2008; 16(11): 1205-1209
Revised: March 5, 2008
Accepted: April 11, 2008
Published online: April 18, 2008
AIM: To humanize and optimize the single chain variable fragment (scFv) DM specific against hepatocellular carcinoma (HCC), and simultaneously to get humanized scFvs with high affinity and low immuogenicity.
METHODS: The amino acid sequence and the model structure of scFv DM were investigated to identify murine framework residues that most likely contribute to the integrity of binding site. All the residues that were difficult to decide were included as human and murine alternatives in the combinatorial library. The full-length humanized scFv gene fragments were synthesized with splicing overlap extension-polymerase chain reaction (SOE-PCR). Phage display technique was used to construct a humanized combinatorial library. Hepatocarcinoma cell-specific scFvs were selected by panning with HCC cell line, and the specificity of those selected scFvs for HCC was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The relative affinities of phage antibodies of the positive clones and the primitive clone DM were measured by ELISA using thiocyanate elution.
RESULTS: A humanized combinatorial library was constructed successfully, and the real content of the library was 4.77 × 105 and contained a total of 128 variant humanized DM consisting of 25 different heavy chains and 22 different light chains. Three selected positive clones HDM1, HDM2, and HDM3 were obtained after two rounds of panning and ELISA detection, and their relative affinities were 1.6, 1.2 and 2.2 mol/L, respectively.
CONCLUSION: Combinatorial library strategy is an effective and simple method for humanization of antibodies. All of the selected positive clones, HDM1, HDM2 and HDM3, have high specificity and affinity against HCC as the primitive clone DM.
- Citation: Ye G, Yang DH, Tang SH, Huang W, Ding SH, Luo JL. Optimized humanization of a single chain variable fragment against hepatocellular carcinoma using a combinatorial library. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2008; 16(11): 1205-1209
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v16/i11/1205.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v16.i11.1205
原发性胆管结石, 特别是肝内胆管结石, 为亚洲常见疾病, 也是胆道外科难以解决的问题之一[1]. 有关肝内外胆管结石的手术治疗方式和治疗原则, 报道较多. 本文主要讨论肝内外胆管巨大和嵌顿结石的非手术治疗.
在外科治疗结石方面, 胆管内巨大和嵌顿结石的处理是胆道外科医师术中和术后面临的难题[2]. 巨大和嵌顿结石使得常规手术中胆道器械取石碎石无法完成, 用活检钳通过胆道镜操作孔一点点啃碎嵌顿或巨大的结石, 既费时又易失败. 即使在胆道镜下看到结石, 嵌顿的结石用常规胆道镜下取石网抓取结石难以完成, 若结石巨大即使抓住结石也难以从胆道内拉出, 造成看见结石而无法取出, 网住结石又无法拉出的尴尬局面. 有时强行拉取结石可造成网篮损坏、胆管损伤, 利用T管窦道取石时可造成窦道撕裂, 胆汁性腹膜炎等, 甚至不得不把网篮剪断而把网住的结石再放开. 为解决此难题, 胆道外科医师与从事物理专业的科学家一起进行研究, 找出一些解决办法.
等离子体冲击波碎石(plasma shock wave lithotripsy, 简称PSWL)是用磁压(F = B2/8π)发放冲击波. PSWL是通过磁压衍生而来. 总的磁能是个常数. 在磁场B存在条件下, 减小面积可以增加B的磁性, 给予低能量就可获得一个较强的波. PSWL有3个优点: (1)在腔内发放PSWL击碎结石时, 波不击向管壁; (2)PSWL与胆道镜合用时, 由于用的是低能, 故无热损伤, 既不损伤胆道镜, 也不产生蒸汽模糊视野; (3)当PSWL作用于弹性缓冲体时, 他是有选择性的. PSWL发放冲击波击碎结石, 当冲击波作用于弹性体时, 击碎的作用有选择. 所以PSWL可以击碎无弹性的结石同时使得有弹性的软组织完整无缺[3]. 本院同中国科学院物理所通过动物实验和初步临床应用, 把PSWL和胆道镜联合应用, 观察其碎石的效果和安全性, 并逐步从动物实验过渡到临床实施[4-6].
为验证PSWL的效能及安全性, 在兔小肠内放置人胆石, 用PSWL进行碎石实验, 控制电压2.5-3.5 kV, 每次发放能量在2-3 J, 发放PSWL不到20次就可以成功击碎结石而对周围肠壁不产生肉眼可见损伤; 即使把PSWL探头直接对肠壁发放PSWL也不造成肠壁损伤, 偶尔可在肠黏膜上出现点状出血点. 这充分说明PSWL的安全性和击碎结石的效果都是可靠的. 如果把电压提高至10 kV, 把能量输出提高至4 J, PSWL可以击穿兔肠壁[4]. 在设计PSWL碎石仪时, 根据动物实验结果, 把电压和能量输出固定在2.5-3.5 kV, 每次发放能量在2-3 J, 然后进行临床试用和应用.
我院1988-09/2007-10共用PSWL和胆道镜联合治疗患者98例, 其中男42例, 女56例, 年龄25-83(平均52±3)岁. 其中3例患急性胆囊炎合并胆囊结石, 曾行胆囊造瘘术; 42例患胆总管结石行胆总管切开取石, T管引流术; 53例患肝内胆管结石(合并或不合并肝外胆管结石), 行胆总管切开探出, 取石钳取石, 必要的肝切除、T管引流及不同形式的胆肠吻合术. 本组患者中有49例转院至本院, 其中有患者已行8次胆道镜取石均未成功. 49例为本院患者. 所有患者用PSWL碎石和胆道镜取石都未试用麻醉和镇静剂. 拔除胆囊引流管或T管, 从窦道内置入可弯曲的CHF-T20纤维胆道镜(Olympus, 外径6 mm, 操作孔2.6 mm). 一旦发现嵌顿结石, 可经胆道镜操作孔置入PSWL探头(探头长100 cm, 外径2 mm, 同取石篮一样可弯曲, 由中国科学院物理所和北京大学第三医院共同研制), 把探头尖端对准结石, 保持5 mm的距离. 根据PSWL碎石仪的设定, 每次发放冲击波所用电伏为2.5-3 kV, 能量输出为2-3 J. 击碎每个嵌顿结石所需用的PSWL发放次数因人而异. PSWL爆破直至结石破碎可用取石篮取出或用生理盐水经Oddi括约肌冲入十二指肠为止. 整个操作过程中, 经胆道镜操作孔注入生理盐水(500 mL加庆大霉素4 μ)使操作视野清楚.
98例患者中, 共发现266枚胆管内嵌顿结石. 结石部位分布见表1. 肉眼观察肝内外胆管嵌顿结石符合胆固醇结石特征的占19.2%(51/266); 符合胆色素结石特征的占80.8%(215/266). 在胆道造影片及直视下测定结石大小. 结石直径在5-50 mm之间, 其中<10 mm结石24枚; 10-20 mm结石216枚; 21-30 mm结石23枚; >30 mm结石3枚.
| 部位嵌顿结石 | (n(%)) |
| 远端胆管 | 38(14.3) |
| 胆总管 | 19(7.1) |
| 胆囊管 | 3(1.1) |
| 肝门部胆管 | 14(5.3) |
| 左肝管 | 30(11.3) |
| 左肝内胆管 | 72(27.1) |
| 左肝外胆管 | 12(4.5) |
| 右肝管 | 18(6.8) |
| 右前叶肝管 | 7(2.6) |
| 右后叶肝管 | 47(17.7) |
| 尾状叶肝管 | 6(2.3) |
| 总计 | 266(100) |
本研究中266枚结石, 有264枚被PSWL击碎后用取石网取出. 每次PSWL操作需几分钟至半小时不等. PSWL碎石成功率为99.2%(264/266). 在所有病例中, 击碎结石所需PSWL发放次数<10次的30块结石; 11-50次的110块; 51-100次的83块; >100次的43块. 发放次数最多为700次, 最少仅2次, 平均52±52次.
266块结石中, 有两块结石未被PSWL击碎. 其中1块进行了4次共发放PSWL 1063次但仍无法击碎结石. 该患者进行再次手术, 术中发现一枚直径50 mm巨大结石嵌顿在左肝内胆管, 用取石钳无法取出, 切开左肝管嵌顿处胆管方取出. 另一块结石嵌顿在胆囊颈部, 经2次共发放PSWL 84次, 结石没有击碎, 患者拒绝再行PSWL碎石, 最后行再次胆囊切除术切开胆囊颈部方取出直径30 mm胆固醇结石. 虽然有2例失败, 我们还是认为PSWL是体内碎石的一种有效的方法.
98例患者中, 有96例PSWL碎石后用取石网经胆道镜操作孔成功取出. 取石成功率98%(96/98). 仅1次胆道镜取净结石者55例; 2-5次取净者35例; 6-10次者7例; 用18次者1例; 平均次数2±24. 共行胆道镜220次.
在经胆道镜PSWL碎石过程中, 所有患者都有振动感. 其中16例患者有右上腹轻微疼痛但能忍受. 13例患者肝内或肝外胆管壁上有轻微的点状出血, 估计可能是发放PSWL时击到胆管壁上所致. 出血很短暂, 用生理盐水冲洗2 min内自动停止. 操作中及其后无相关严重并发症发生.
由于肝内胆管分叉、狭窄和成角, 有时很难把胆道镜放到结石嵌顿的部位. 所以, 有时在用PSWL碎石时不可避免地把冲击波既发放到结石上又发放到胆管壁上. 在本研究中, 有11处肝内胆管被PSWL直接击中, 该部位的炎症管壁有少许出血并在2 min内自动停止. 在整个治疗中和治疗后, 无其他严重并发症发生. 我们认为用PSWL在体内击碎结石是一种十分安全的方法. PSWL探头可弯曲, 可以通过胆道镜操作孔很容易地放到嵌顿结石的部位直接对准结石击碎. PSWL探头尖端可以前后调节. 最佳位置为距结石5 mm, 在此位置能发放最大有效能量.
PSWL的安全性和效果都是肯定的. 而正是过分强调安全, 所以能量可能不是特别大, 致使有的结石无法击碎取出. 从动物实验可以看出, 工作安全电压和能量输出之间有一个较大的空间, 能否再增加电压和输出能量又不造成胆道损伤值得进一步研究.
体外冲击波碎石(extracorporeal shock wave lithotripsy, ESWL)作用原理是通过在液体中放电产生高振幅的不同波长的液压成功击碎体内外结石. 体外碎石器利用椭圆形反射器反射冲击波到体内部位而击碎结石. 这种反射器有两个焦点, 一个焦点在体外, 描向通过放电释放冲击波处, 另一焦点在体内, 描向结石所在部位. 对胆囊结石的ESWL治疗效果较好, 但其远期复发率很高, 在服用熊去氧胆酸预防结石形成的情况下, 3、5和10年复发率分别在27%、41%和54%, 从长期随访结果看效果不满意, 故只能用于特殊病例[7]. 对高危患者合并胆囊颈部结石嵌顿, 先用ESWL击碎结石再用胆道镜取出结石碎片虽费时但是为一种安全的处理办法[8]. 对胆管下端的嵌顿结石, ESWL常常也难以击碎结石使其排出[9]. 而对于经内镜乳头切开机械碎石失败的胆总管结石, 在X线透视或超声定位下, 用高能量ESWL可以把90%(281/313)的巨大胆管结石击碎, 再经内镜用取石器械取出(80%)或让其自然排出(10%). 其中有4例出现胆管炎, 1例出现急性胆囊炎, 并发症的发生率不高[10]. 由于ESWL需要用X线透视或超声定位方能进行碎石, 操作十分不便, 且对肝内胆管结石罕见有ESWL碎石的报道, 故经过改进, ESWL已经有经过胆道镜操作孔的探头直接对准结石进行碎石的碎石仪问世, 且已经应用到临床. 国外有用液电碎石(electrohydrautic lithotripsy)治疗肝内胆管结石的报道, 击碎结石清除率在76%(13/17)[11] -92%(46/50)[12]之间. 至于安全性, 用ESWL总的并发症发生率在13.2%(12/90)[13]-22%(11/50)[12]. 操作过程中需注意: (1)电极应离开镜端3-5 mm, 以防损伤内镜, 且利于碎石. (2)电极应尽量对准结石的中心部位, 而将电极置于结石的裂隙中或结石与胆管壁之间都被认为是危险的. (3)ESWL应在充满生理盐水的胆道中进行, 努力保持视野清晰, 防止损伤胆管壁. (4)碎石的大小以能用网篮拉出或用水能冲出胆道为宜. (5)胆管内感染严重不易碎石取石, 需等炎症好转后再进行[10]. 王卫东 et al[14]对1246例患者进行了ESWL碎石取石, 成功率高达97.9%, 说明ESWL的碎石效果是肯定的. 本组40%患者有发热, 且20%患者需用抗生素或退热处理, 提示ESWL后发热的风险还是很大的. ESWL操作过程中最担心的并发症是出血和穿孔的问题. 本组镜下出血占11.1%, 需镜下滴注加肾上腺素的生理盐水后方能止血, 并有1例击穿胆管引起大出血、1例撕裂胆管引起大出血而需急诊手术的病例发生. 而引起这些并发症的原因可能是ESWL能量较强, 既可以击碎结石, 又可以损伤胆管壁之故. Harrison et al[15]建议为避免出现严重并发症, ESWL探头不准直接接触胆管壁.
激光碎石术(laser lithotripsy)的原理是激光产生的机械能和热能, 使激光光纤和结石之间的水产生汽化, 形成微小的气泡, 把能量传至结石使结石碎裂. 激光碎石功率设置一般在28-30 W, 能量输出在40 J/s. 因激光可以切割可凝固组织, 所以激光碎石术中要保持视野清晰, 及时清除碎石过程中所泛起的气泡、胆泥和炎性絮状物. 必须持续快速地向胆管内灌注生理盐水降温, 注水流速<40 mL/min, 并适当调整两次发射激光的时间间隔, 以避免激光热效应灼伤周围肝胆组织. 光纤照射中心应对位在结石中心, 避免置于胆管壁和结石之间, 防止误伤胆管壁. 应避免不要把结石击穿, 防止无法控制的胆管壁损伤, 且激光光纤和胆管壁之间必须保留1 mm安全利用激光的距离, 免得损伤胆管. Orii et al[16]报告用钇-铝激光可以产生足够的能量击碎胆色素结石(8例), 但是击碎胆固醇结石的能量就显得不够(3例). Prat et al[17]报告16例难取的胆管结石用激光碎石. 激光碎石清除结石总的成功率87.5% (14/16), 并发症18.8%(3/16), 包括胆血症、发热和出血. 根据Harris et al[18]最好的结果, 激光碎石成功率96%(24/25), 并发症28%(7/25), 包括出血、发热和寒战. 这些并发症可能是由激光纤维的尖端顶到胆管壁上所致[17]. 因此, 放置激光丝通过镜的末端时要格外小心, 并把镜身伸直才能把激光丝拉出体外. 如果在镜身弯曲的情况下外拉, 这种相对硬、锐的激光丝可能损伤操作孔的侧壁. 在激光丝位于操作孔内时发放激光也有可能损伤操作孔内衬. 这些缺点限制了激光碎石的效果. 由于激光碎石必须使激光光纤放置到结石所在得部位, 且成角胆管和细小胆管都无法进入, 所以Hochberger et al[19]强烈建议激光碎石只能用在胆囊和胆总管, 不能用在肝内胆管. 随着激光纤维技术的改进, 现有外径3 mm能通过粗胆道镜操作孔的激光光纤供临床应用[20], 可能会使激光碎石的应用范围扩大, 安全性提高, 效果更好.
超声碎石技术早期是应用到胆囊结石经皮胆镜取石、碎石, 后应用到肝内外胆管结石的治疗. 也属于硬质镜. 他的好处在于边冲洗、边碎石、边吸出. 超声碎石在清除结石的同时, 通过镜鞘或超声碎石头部的扩张以及超声的作用, 可以解除胆管的膜状狭窄. 由于超声碎石的作用较强大, 所以巨大难取结石、嵌顿结石或肝内胆管充满的塑型结石只要超声探头能进入, 碎石的效果好, 速度快. 缺点是超声碎石对结石和胆管无选择性, 故有胆管损伤的危险, 同时探头较大, 只能通过硬质镜, 无法通过纤维胆道镜的操作孔, 对较细小分支、有角度的胆管无法进入碎石, 应用有一定的局限性[20].
Chang et al对304例胆总管内巨大结石, 直径>15 mm, 或用常规的取石网蓝或气囊无法取出的结石, 先经内镜用刀切开十二指肠乳头(endoscopic papillotomy, EPT), 再用日本Olympus BML-40机械碎石器进行碎石, 89.5%的巨大难取结石成功碎石并取出, 32(10.5%)例碎石失败而改行手术取石. 在碎石取石成功的272例患者中, 其中211例一次碎石取石成功, 61例进行了多次碎石取石. 共有8例出现了胆管炎, 21例出现了胰腺炎, 10例出现了延迟出血, 均保守缓解, 并发症发生率为10.7%(39/272), 没有死亡[21]. 经十二指肠镜的机械碎石器械力量较强, 关键问题是EPT能否成功, 碎石网能否套住胆管内结石并把结石夹碎, 失败的几率较高, 并发症较多, 并需有EPT所需要的成套设备, 也限制了其应用范围. 虽然有利用活检钳咬碎结石; 用1% 利多卡因注入含残石胆管, 使胆管壁松弛, 结石松动, 再用取石网套住结石拉出; 用生理盐水加压冲洗胆道使结石松动, 再用网蓝碎石取石; 经胆道镜操作孔注入H2O2于结石表面, 使之被腐蚀变小而取出的报告, 但在局麻组因结石大而撕裂T管窦道引起局限性腹膜炎的发生率高达13/17(76.5%)[22], 也属不可用之列. 胆道镜下的机械碎石力量较小, 取石网多是抓取结石外拉, 而难以夹碎, 用活检钳咬夹结石效率极低, 既费时又费力, 必须借助其他碎石手段击碎结石再拉出比较合适.
该技术最早应用于泌尿外科. 其原理是借助输尿管镜通过一台高压气泵间歇地传出高压气流, 作用在一个子弹头样的装置上, 再通过该装置撞击冲击杆撞击结石, 将结石击碎. 同时该装置还配备有加压冲水泵, 工作时间间断冲水, 碎石屑顺水流出. 该技术的局限性在于: (1)因是硬镜, 可转角度受限, 尤其是在T管窦道操作时更是如此. 故T管窦道要求尽可能近、短、直, 操作要轻柔, 避免撕裂胆管. (2)冲击杆碎石时要掌握好分寸, 否则有可能击穿胆管壁. (3)输尿管镜视野有限, 在扩张的胆管内看不见整个管腔, 碎石时结石易漂移, 给碎石造成困难[23].
总之, 肝内外胆管巨大和嵌顿结石的非手术治疗取得了长足的进步, 手段和方法较多, 可以根据各自的实际情况选用不同的方法, 扬长避短, 使对肝内外胆管复杂难取结石的治疗更安全、更有效.
肝内外胆管巨大和嵌顿结石的非手术治疗取得了长足的进步, 手段和方法较多, 可以根据各自的实际情况选用不同的方法, 扬长避短, 使对肝内外胆管复杂难取结石的治疗更安全、更有效.
程爱群, 主任医师, 上海华东医院普外科
在外科治疗结石方面, 胆管内巨大和嵌顿结石的处理是胆道外科医师术中和术后面临的难题.
Chang et al对304例胆总管内巨大结石, 直径>15 mm, 或用常规的取石网蓝或气囊无法取出的结石, 先经内镜用刀切开十二指肠乳头(endoscopic papillotomy, EPT), 再用日本Olympus BML-40机械碎石器进行碎石, 89.5%的巨大难取结石成功碎石并取出, 32(10.5%)例碎石失败而改行手术取石.
与其他碎石方法比较, PSWL是一种安全、有效、便利的碎石方法.
本文分析胆道结石非手术治疗的各种方法的优缺点, 提出一些注意事项, 对临床具有一定的参考价值和指导意义.
编辑:李军亮 电编:何基才
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