研究快报 Open Access
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世界华人消化杂志. 2007-09-28; 15(27): 2927-2930
在线出版日期: 2007-09-28. doi: 10.11569/wcjd.v15.i27.2927
T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术检测人CEA
朱自满, 李世拥, 安萍, 白雪, 于波
朱自满, 李世拥, 安萍, 白雪, 于波, 北京军区总医院全军普通外科中心 100700
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30471700.
通讯作者: 于波, 100700, 北京市东城区南门仓五号, 北京军区总医院全军普通外科中心. yubo66@126.com
电话: 010-66721188
收稿日期: 2007-05-31
修回日期: 2007-09-13
接受日期: 2007-09-28
在线出版日期: 2007-09-28

目的: 探建立检测人癌胚抗原(CEA)的T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术(fluorescent amplification catalyzed by T7 polymerase technique, FACTT).

方法: 以亲和素作为连接分子, 连接生物素化的检测抗体和生物素化的DNA, 加入T7RNA聚合酶进行转录扩增反应, 对生成的RNA产物进行荧光检测, 并同时进行夹心酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)方法检测人CEA.

结果: 成功的建立了检测人CEA的T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术, 其检测CEA的灵敏度达2×10-3 mg/L, 比夹心ELISA 方法灵敏度(0.25 mg/L)高125倍.

结论: T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术较夹心ELISA方法具有更高的敏感性, 有可能作为一种新的检测方法用于临床的早期诊断.

关键词: T7 RNA聚合酶; 荧光扩增技术; 癌胚抗原; 酶联接免疫吸附剂测定

引文著录: 朱自满, 李世拥, 安萍, 白雪, 于波. T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术检测人CEA. 世界华人消化杂志 2007; 15(27): 2927-2930
Detection of human carcinoma-embryonic antigen using fluorescent amplification catalyzed by T7 polymerase technique
Zi-Man Zhu, Shi-Yong Li, Ping An, Xue Bai, Bo Yu
Zi-Man Zhu, Shi-Yong Li, Ping An, Xue Bai, Bo Yu, the Chinese PLA Center of General Surgery, Beijing General Military Hospital, Beijing 100700, China
Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30471700.
Correspondence to: Dr. Bo Yu, the Chinese PLA Center of General Surgery, Beijing General Military Hospital, 5 South Door Cang, East Cheng District, Beijing 100700, China. yubo66 @126.com
Received: May 31, 2007
Revised: September 13, 2007
Accepted: September 28, 2007
Published online: September 28, 2007

AIM: To establish a new method for the detection of human carcinoma-embryonic antigen (CEA) using fluorescent amplification catalyzed by T7 polymerase technique (FACTT).

METHODS: Avidin was used to bridge biotinylated detection antibody and biotinylated DNA. T7 RNA polymerase was added to perform RNA amplification. RNA products were quantified by adding the RNA intercalating dye RiboGreen. CEA was determined by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

RESULTS: The detection limit of FACTT for human CEA was 2 × 10-3 mg/L, which was 125 times more sensitive than ELISA (0.25 mg/L), which was performed in parallel.

CONCLUSION: The FACTT has a higher sensitivity than sandwiched ELISA for the detection of human CEA, and may be a powerful and very sensitive tool for early stage clinical diagnosis.

Key Words: T7 RNA polymerase; Fluorescent amplification; Carcinoma-embryonic antigen; Enzyme-linked immunosorbent assay


0 引言

T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术(fluorescent amplification catalyzed by T7 polymerase technique, FACTT)是由Zhang et al[1]建立的一种新的抗原检测方法. 他将抗原抗体的反应的特异性、T7 RNA聚合酶的线性扩增能力以及荧光检测的敏感性结合在一起, 提高了对抗原检测的敏感性, 而且整个实验过程均在室温下进行, 而免疫PCR则需要不断改变反应体系的温度, 所以本实验的重复性更好. 目前临床上均使用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测肿瘤标志物, 检测极限范围大多在0.01-50 mg/L之间[2]. 本研究通过建立检测人CEA的T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增方法, 并与夹心ELISA方法比较其灵敏度, 为进一步使用该方法检测其他肿瘤标志物奠定基础.

1 材料和方法
1.1 材料

CEA捕获抗体、检测抗体、生物素化抗体及CEA标准品, CEA夹心ELISA检测试剂盒均购自Canag公司; 亲和素、生物素, RiboGreen购自Invitrogen公司, DNA模板pGEM®购自Promega公司(含有T7启动子及T7终止子), NTP、T7 RNA polymerase plus购自Ambion公司. 引物序列: F: 5'CTCTTCGCTATTACGCCAGG 3'; R: 5'CAATACGCAAACCGCCTC3', 由鼎国公司合成, 其中上游引物5'端碱基上带有生物素标记. 荧光连续测读仪Thermo Ascent公司.

1.2 方法

生物素化DNA指示分子的构建按文献报道进行[3-5]. 根据DNA的核苷酸序列用DNA Star软件设计1对引物, 其中上游引物的5'端碱基上带有生物素标记. 以pGEM®为模板进行PCR扩增, 扩增产物回收后纯化并定量测定, 保存在-20℃. 夹心ELISA方法严格按照说明书进行操作. FACTT方法检测人CEA按文献进行[1]. 取96孔板一块, 每孔加60 µL捕获抗体(用碳酸盐-碳酸氢盐包被缓冲液稀释成5 mg/L)4℃过夜. 加10 g/L酪蛋白封闭液, 22℃ 1 h. 加20 µL待检抗原(包括对照品, 位于1 mL/L的FBS中)22℃孵育1 h. 加20 µL稀释的生物素化检测抗体(180 mg/L)22℃孵育1 h. 加5 mg/L链亲和素22℃孵育1 h. 加500 mg/L生物素化DNA(扩增模块)22℃孵育1 h. 洗板液PBST(含1 mL/L Tween20的PBS)洗板6次, 在每次结合孵育后. 洗板后, 每孔加20 µL反应混合液, 组成: 60 U T7RNA聚合酶(ambion), 1.25 µmol NTP, 1×T7缓冲液. 37℃孵育3 h. 加入RNase抑制剂, 加20 µL RiboGreen(1:200稀释, 按说明书进行). 在荧光光谱仪上测量(激发波长485 nm, 发射波长535 nm).

2 结果
2.1 双抗夹心ELISA 法检测人CEA的结果

取2 mg/L的人CEA标准品, 以稀释液倍比稀释后得系列稀释度的待测品, 浓度分别是2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L、0.25 mg/L、0.125 mg/L、0.0625 mg/L, 每个浓度设3个复孔. 检测极限的判定: 大于阴性对照组的平均A值加上其3倍的标准差所对应的浓度值. 结果双抗夹心ELISA 法最低可检测出0.25 mg/L的人CEA(图1).

图1
图1 双夹心ELISA方法检测人CEA的结果.
2.2 FACTT方法检测人CEA的敏感度

取2 mg/L的人CEA标准品, 以稀释液作10倍系列稀释后获得系列稀释度的待测品, 浓度分别是2 mg/L、0.2 mg/L、2×10-2 mg/L、2×10-3 mg/L、2×10-4 mg/L、2×10-5 mg/L, 每个浓度设3个复孔. 检测极限的判定: 大于阴性对照组的平均A值加上其3倍的标准差所对应的浓度值. FACTT方法最低可检测出2×10-3 mg/L的人CEA(图2).

图2
图2 FACTT方法检测人CEA结果.
3 讨论

FACTT(fluorescent amplification catalyzed by T7 polymerase technique), 即T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术[1], 原理与免疫PCR相似[6], 只是用T7 RNA聚合酶代替免疫PCR中的Taq聚合酶, 终产物为RNA分子. 通过1个对DNA和检测抗体具双重活性的连接分子, 使作为标志物的DNA分子特异地结合到抗原-抗体复合物, 作为标志物的DNA分子含有T7启动子及T7终止子[7-8], 随后加入的T7 RNA聚合酶以DNA标志物为模板生成线性的RNA, 线性RNA产物的存在标明DNA标志物分子特异地与抗原-抗体复合物发生了连接, 进而证明抗原的存在; 而RNA产物的定量分析可间接反映被测抗原的浓度. FACTT实验体系的基本组成包括待检测抗原、一对抗体(针对待检测抗原不同表位的捕获抗体及检测抗体)、连接分子、DNA指示分子、T7 RNA聚合酶和RNA荧光检测染料[9].

CEA(癌胚抗原)是一种糖蛋白, 是由Gold(戈德)和Freedman(弗里德曼)在结肠癌患者和内胚层(胃肠道)的上皮肿瘤中首次发现的[10-11]. 免疫学检测发现体内存在许多CEA样的分子. 所以本实验采用针对人CEA的一对mAb, 可克服这些交叉反应性CEA样分子的干扰, 其中检测mAb针对Gold抗原决定簇Ⅳ, 捕捉mAb针对Gold抗原决定簇Ⅴ[12].

FACTT中作为标志物的DNA分子应包含有T7启动子及T7终止子, 而且长度应足够, 还要保证DNA分子的纯度, 不选用待检测样品中可能存在的DNA分子. 本研究选用含有T7启动子及T7终止子的pGEM®线性载体作为DNA模板, 根据其序列设计一对引物, 其中上游引物的5'端生物素化, 进行PCR获得大量生物化的DNA指示分子, 纯化并定量后使用, 实验结果表明所产生的生物素化DNA完全能满足实验的需要. 确定了生物素化DNA及生物化抗体的最佳浓度.

FACTT的终产物是通过T7 RNA聚合酶扩增的RNA分子, Ribogreen荧光染料能特异性地检测线性RNA分子, 不与游离的核糖核酸分子结合, 因此能极大地提高检测RNA分子的灵敏度[9].

我们建立了检测人CEA的T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增方法, 实验中采用亲和素作连接分子, 生物素化抗体和生物素化DNA分子是以游离的方式加入, 使亲和素与生物素结合, 冲洗后, 再加入生物素化的DNA. 结果表明, FACTT方法可检测到2×10-3 mg/L的人CEA, 比夹心EL ISA 检测方法灵敏度高125倍.

FACTT是新近发展的一种免疫检测技术, 他提高了ELISA检测的灵敏度, 可以检测出ELISA测不出的抗原物质, 而且FACTT均在室温下进行, 反应条件温和, 有别于免疫PCR, 需要改变反应的条件, 所以FACTT的重复性更好.

FACTT作为一种新的检测抗原方法, 虽然具有灵敏度高的优点, 但是操作步骤较多, 洗板次数频繁, 而且实验的最终产物为RNA. 由于RNA酶的无处不在, 所以RNA容易受到污染而降解. 为了避免RNA酶的污染, 实验操作要严谨, 注意实验环境及所有使用液体的无RNA酶处理, 可以避免或减少终产物RNA分子的降解. 如果将检测抗体与DNA分子预结合成复合物或者直接连接, 则可以大大减少实验步骤, 节约实验时间, 减少污染的机会, 将有助于临床大规模使用.

评论
背景资料

CEA(癌胚抗原)是一种糖蛋白,是由Gold(戈德) 和Freedman(弗里德曼 ) 在结肠癌患者和内胚层 (胃肠道) 的上皮肿瘤中首次发现的, FACTT即T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术, 原理与免疫PCR相似, 目前临床上均使用酶联免疫吸附试验检测肿瘤标志物.

名词解释

FACTT: T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术, 是一种新的抗原检测方法, 他将抗原抗体反应的特异性、T7RNA聚合酶的线性扩增能力及荧光检测的敏感性结合在一起, 较ELISA具有更高的敏感度.

同行评价

本文阐述了T RNA聚合酶催化的荧光扩增技术较ELISA方法具有更高的敏感性,可用于临床的早期诊断, 方法成熟, 分析有据, 有一定的可读性和应用性.

编辑:程剑侠 电编:李军亮

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