外源性一氧化碳对小肠缺血再灌注大鼠血中碳氧血红蛋白的影响

摘要

目的: 通过检测大鼠血中碳氧血红蛋白(COHb)浓度的变化, 探讨小肠缺血再灌注过程中外源性应用不同浓度一氧化碳的安全性.

方法: ♂Wistar大鼠32只, 随机分为假手术对照组(Ⅰ组)、小肠缺血再灌注组(Ⅱ组)及缺血时吸入浓度分别为100、250 μL/L一氧化碳(CO)的Ⅲ、Ⅳ组;制作小肠缺血再灌注模型. 分别于缺血前15 min(T1), 缺血后1 h(T2), 再灌注后1 h(T3)、2 h(T4)取动脉血测定COHb浓度.

结果: Ⅰ组及Ⅱ组缺血再灌注前后各时点COHb浓度无明显差异, Ⅲ、Ⅳ组缺血后的T2(4.1%±1.3%, 10.1%±3.0% vs 1.0%±0.2%)、T3(5.8%±1.1%, 13.1%±2.8% vs 1.2%±0.3%)、T4(6.8%±1.2%, 13.3%±3.1% vs 1.1%±0.2%)时点与Ⅱ组相应时点比较, COHb浓度升高(P<0.05).

结论: 大鼠小肠缺血再灌注过程中外源性应用100 μL/L和250 μL/L的CO均是安全的.

关键词: 小肠; 再灌注损伤; 碳氧血红蛋白; 一氧化碳

Effect of exogenous carbon monoxide on carboxyhemoglobin blood concentration during intestinal ischemia/reperfusion in rats

Ning Han, Wei-Min Chen

Ning Han, Wei-Min Chen, Department of Anesthesiology, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China

Correspondence to: Ning Han, Department of Anesthesiology, Shengjing Hospital of China Medical University, 36 Sanhao Street, Heping District, Shenyang 110004, Liaoning Province, China. hann@cmu2h.com

Received: April 14, 2007
Revised: September 15, 2007
Accepted: September 28, 2007
Published online: September 28, 2007

Abstract

AIM: To evaluate the safety of exogenous carbon monoxide inhaled during intestinal ischemia/reperfusion (IR) in rats, and to monitor its effect on carboxyhemoglobin (COHb) blood concentration.

METHODS: Thirty-two male Wistar rats weighing 220-260 g were randomly divided into four groups of eight rats each: group Ⅰ, sham operation (control group); group Ⅱ, small intestinal IR; group Ⅲ, 100 μL/L carbon monoxide (CO) inhalation; and group Ⅳ, 250 μL/L CO inhalation. Superior mesenteric artery (SMA) was isolated and clamped for 60 min, followed by 120 min reperfusion. In groups Ⅲ and Ⅳ, different doses of CO were continuously inhaled from the time of the SMA being clamped to the end of the experiment. In groups Ⅰ and Ⅱ, air was inhaled instead of CO. Blood samples were taken before the SMA was clamped, at 15 min before ischemia (T₁), 1 h (T₂) after ischemia, and 1 h (T₃) and 2 h (T₄) after reperfusion, for determination of COHb blood concentrations.

RESULTS: The COHb blood concentration increased significantly after CO inhalation in groups Ⅲ and Ⅳ when compared with group Ⅱ at T2, T₃ and T₄ (4.1% ± 1.3% and 10.1% ± 3.0% vs 1.0 ± 0.2%; 5.8% ± 1.1% and 13.1% ± 2.8% vs 1.2% ± 0.3%; 6.8 ± 1.2 and 13.3% ± 3.1% vs 1.1% ± 0.2%; P < 0.05).

CONCLUSION: It is safe to inhale 100 μL/L and 250 μL/L CO during intestinal IR in rats.

Key Words: Small intestine; Reperfusion injury; Carboxyhemoglobin; Carbon monoxide

0 引言

研究发现, 过去一直被认为是毒性气体的一氧化碳(CO, carbon monoxide)作为细胞信使在人体各种生理和病理过程中发挥着重要调节作用[1-4].本文通过复制大鼠小肠缺血再灌注(IIR, intestinal ischemia-reperfusion)模型, 检测IIR过程中给予外源性CO时血中碳氧血红蛋白(COHb)的变化, 确定外源性CO应用于此病理生理过程的安全性, 为进一步研究外源性CO防治IIR所致多器官损伤的作用提供可行性依据.

1 材料和方法

1.1 材料

实验动物健康♂Wistar大鼠32只, 体质量220-260 g; 由中国医科大学实验动物中心提供. 实验试剂和药品: 标准一氧化碳气体(大连大特气体有限公司提供, 钢瓶号: 982910/9200219,压力: 9.0 MPa, 浓度: 250×10^-6/100×10^-6, 空气平衡); 乌拉坦(200 g/L). 实验器材: CIBA-CORNING238型血气分析仪, Detax压力监测仪, B-D微量输液泵和B-D动静脉留置套管针(美国), 大鼠气管插管和带单向活瓣T型管(自制); 小动物手术器械等.

1.2 方法

1.2.1 动物分组: 大鼠实验前禁食12 h, 自由饮水. 随机分为假手术对照组(Ⅰ组)、小肠缺血再灌注组(Ⅱ组)及吸入浓度分别为100 mL/L、250 mL/L一氧化碳的Ⅲ、Ⅳ组. 每组8只.

1.2.2 动物模型制作: 采用肠系膜上动脉(Superior Mesenteric Artery, SMA)夹闭-开放方式复制IIR模型[2]. 大鼠ip乌拉坦(1.0 g/kg)麻醉, 开放股静脉持续微泵输注乳酸钠林格氏液(10 mL/kg•h). 行颈动脉置管(用于测定动脉压及采血), 气管切开插管后接带单向活瓣T型管(活瓣能保证吸入气为所需气体, 呼出气进入大气), 保留自主呼吸. 常规消毒后取腹正中切口3-4 cm, 游离SMA, 血压平稳10 min后用显微手术用无损伤动脉夹关闭SMA起始部, 造成肠缺血; 缝合切口, 60 min后经原切口入腹腔, 去除动脉夹, 恢复小肠血供120 min即为IIR模型. Ⅰ组除不阻断SMA外, 操作与其他组相同. Ⅲ、Ⅳ组于缺血前10 min开始时分别吸入相应浓度的CO. 再灌注时为防止血压急剧下降, 快速补充乳酸钠林格氏液1-2 mL/次.

1.2.3 观察指标和检测方法: 实验中连续监测大鼠动脉压(MAP)变化, 分别于缺血前15 min(T₁), 缺血后1 h(T₂), 再灌注后1 h(T₃)、2 h(T₄)记录MAP值. Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别于T₁、T₂、T3、T4时点取颈动脉血0.3 mL; Ⅰ组于相应时点取血. 以血气分析仪测定血气值及血中COHb值.

统计学处理 本实验所有数据以均数±标准差(mean±SD)表示. 采用SPSS13.0专业统计软件对数据进行单因素方差分析和t检验. P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 动物基础情况

各组动物体质量、基础血气值、基础血红蛋白值(Hb)均在正常范围内, 组间无显著性差别(P>0.05, 表1).

表1 各组动物基础情况(n = 8, mean±SD).

分组	体质量(g)	pH	PaO2(mmHg)	PaCO2(mmHg)	Hb(g/L)
I组	240±13	7.2±0.1	55.2±3.8	44.5±5.5	133±16
II组	236±15	7.2±0.1	53.6±4.0	42.6±6.3	122±17
III组	238±16	7.2±0.1	56.3±2.6	46.2±5.3	132±10
IV组	237±15	7.2±0.0	54.6±3.0	43.7±5.4	131±19

2.2 各组动物MAP的变化Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组同Ⅰ组相应时点比较, 再灌注后的T3、T4时点MAP下降显著(P<0.01); Ⅲ、Ⅳ组同Ⅱ组相应时点比较, CO吸入后的T₂、T₃、T₄时点MAP变化无明显差异(P>0.05)(表2).

表2 各组动物MAP变化和各时点COHb值情况(n = 8, mean±SD).

分组		T1	T2	T3	T4
MAP(mmHg)	I组	115±15	95±12	90±7	83±8
	II组	120±9	91±10	72±9f	65±8f
	III组	118±7	92±7	71±6f	68±5f
	IV组	121±8	102±13	78±6f	72±4f
COHb(%)	I组	1.3±0.4	1.1±0.3	1.3±0.2	1.3±0.6
	II组	1.1±0.3	1.0±0.2	1.2±0.3	1.1±0.2
	III组	0.9±0.3	4.1±1.3ac	5.8±1.1ac	6.8±1.2ac
	IV组	0.9±0.2	10.1±3.0bd	13.1±2.8bd	13.3±3.1bd

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs II组相应时点;

^cP<0.05,

^dP<0.01 vs 本组T₁时点,

^fP<0.01 vs I组相应时点.

2.3 各组动物血中COHb的变化

Ⅰ组各时点、Ⅱ组缺血及再灌注前后各时点COHb浓度无明显差异(P>0.05). Ⅲ、Ⅳ组缺血后(即吸入CO后)的T₂、T₃、T₄时点与Ⅱ组相应时点比较, COHb浓度升高(P<0.05), 且Ⅳ组升高更显著(P<0.01). 与本组缺血前的T1时点相比, Ⅲ组COHb浓度升高(P<0.05); Ⅳ组COHb浓度升高显著(P<0.01)(表2).

3 讨论

CO无色、无味、无刺激性, 过去一直被认为是一种毒性气体分子, 因此对他的研究多局限在毒理学领域. 其中毒机制是: CO与人体红细胞内Hb分子的原卟啉的亚铁复合物发生紧密而可逆的结合, 形成COHb, 妨碍Hb与O2的结合与解离, 从而造成组织缺氧. 神经系统由于对缺氧最敏感且耐受最差, 因此毒性伤害发生最早也最重. 判断CO对生物体产生的毒性伤害程度有许多生理学、神经学和病理学指标, 而测定血中COHb浓度是其中最重要和最直接的方法之一. 研究显示: 当人体血中COHb超过10%时, 可引起头痛、头晕、心悸、呕吐等轻度中毒症状; 超过50%时, 可出现持续昏迷、各种反射消失, 甚至死亡[5]. 与导致大鼠神经行为改变和脑血管损伤相对应的最低COHb阈值是15%-20%[6]. 而随着近年对细胞间信使分子研究的深入, 发现哺乳动物在生理条件下体内普遍存在内源性CO分子, 他们大多由血红素氧合酶(HO)催化血红素降解时产生[7-8], 部分能结合和激活可溶性鸟苷酸环化酶(SGC), 通过调节环磷酸鸟苷(cGMP)的生成起到细胞信使的作用[7].

越来越多的研究发现, CO作为一种细胞信使分子在生物体内具有舒张血管和支气管平滑肌、抑制血小板聚集、抑制炎症反应、抗凋亡、抗增殖等多种生理学作用, 在神经、呼吸、循环等生理过程和抑制急性肺损伤、脏器缺血再灌注损伤、器官移植排斥反应等病理过程中发挥着重要调节作用[9-11]. 由于在严重病理生理过程中内源性CO的产生有限, 不能达到对机体组织的保护作用, 于是作为内源性CO补充的外源性CO的应用问题开始受到人们的关注. 有关"外源性应用CO能否在不引起毒性反应的情况下抑制部分严重病理生理过程的发生和发展"这一课题已经成为危重症治疗领域研究的热点之一. 如Otterbein研究发现, CO可明显提高大鼠对高氧性肺损伤的耐受性: 吸入24 h高浓度氧的大鼠全部死亡, 而同时吸入CO的大鼠全部存活; 吸入CO能明显减轻高氧所致的胸腔积液、肺水肿、PMN在肺中的扣留及肺泡支气管灌洗液中蛋白含量, 使肺细胞凋亡指数下降, 未发现任何副作用[12]. Neto和Nakao et al给接受肾和小肠移植的大鼠从移植前1 h开始至移植IR后24 h连续吸入CO, 与未吸入CO组相比, 围移植期吸入CO可使移植器官减轻IR损伤、改善移植器官功能、发挥抗排斥效应并提高存活率[^13-14].在鼠心脏移植模型中, 连续2 d吸入一定浓度的CO, 其抑制排斥反应的作用可持续达50 d.

本研究对外源性CO应用在大鼠IIR过程中的安全性进行了探索. IIR是机体遭受严重创伤、大手术、烧伤和感染等打击后最早发生的病理生理过程之一, 可以导致肠道屏障功能不全, 引起大量原存在于肠腔内的细菌和内毒素发生移位, 严重时可激发全身性炎症反应(SIRS)的形成, 并最终导致多器官功能衰竭(MODS)[15]. 为避免对大鼠产生毒性作用, 本实验选择的外源性CO的浓度极低, 是CO大鼠半数致死剂量(LD50:1807 mL/L/4 h)的1/20-1/7, 是用于测定人肺弥散功能所用CO浓度(3000 mL/L)的1/12, 甚至低于吸烟时接触的CO浓度(400 mL/L). 实验结果显示: 在整个IIR过程中, 大鼠吸入100 mL/L和250 mL/L的CO, 对MAP没有明显影响. 吸入100 mL/L CO时, 血内COHb升高; 当吸入250 mL/L CO时, 血内COHb虽升高明显, 但最高也仅达到13.3%, 没有超过引起大鼠神经行为改变和脑血管损伤的最低阈值. Otterbein et al[12]的研究也认为正常大鼠持续接受≤250 mL/L的CO并不能引起不良反应的发生. 本研究在大鼠IIR前后测定的血中COHb结果表明, 我们选择的两种浓度的CO 均可以安全地应用在大鼠IIR过程中, 不会产生毒性作用. 至于外源性应用100 mL/L、250 mL/L CO是否能在大鼠IIR过程中对多器官损伤起到防治作用且防治程度有何不同, 还有待于进一步研究.

血中COHb浓度的变化表明, 大鼠IIR过程中吸入浓度为100 mL/L和250 mL/L的CO均是安全的. 这为进一步研究外源性CO防治IIR所致多器官损伤的作用奠定了安全性基础.

评论

背景资料

过去一直被认为是毒性气体的一氧化碳(CO)现被发现其作为细胞信使在人体各种生理和病理过程中发挥着重要调节作用. 而作为内源性CO补充的外源性CO的应用问题开始越来越受到人们的关注.

应用要点

本文通过检测大鼠小肠缺血再灌注过程中给予外源性CO时血中碳氧血红蛋白(COHb) 的变化,确定外源性CO应用于此病理生理过程的安全性, 为进一步研究外源性CO防治IIR所致多器官损伤的作用提供可行性依据.

同行评价

本文设计合理, 思路清晰, 论证有据, 对临床有一定的指导意义和参考价值.

备注

编辑:程剑侠 电编:李军亮

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