食管鳞癌免疫组化彩色图像定量分析

摘要

目的

探讨食管鳞癌免疫组化图像定量分析中描述图像色彩的指标在不同分化程度间的变化及作用.

方法

采用S-P法进行肺癌p53、p21和增生细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色, 应用计算机病理图像分析系统(TD-2000)进行图像分析.

结果

35例食管鳞癌患组中高分化组、中分化组和低分化组p53阳性者分别为7例、9例和9例, PCNA阳性者分别为7例、8例和9例, p21阳性者分别为8例、9例和11例 . 高分化组p53染色的饱和度(2.15±1.21%)、中分化组(4.95±2.99%) 、低分化组(10.95±1.81%), 高分化组和中分化组差异有显著性(t = 2.31, P<0.05), 中分化组和低分化组差异有显著性(t = 5.12, P<0.01); 高分化组PCNA染色的饱和度(3.72±2.81%)、中分化组(7.71±3.91%)、低分化组(12.95±3.89%), 高分化组和中分化组差异有显著性(t = 2.24, P<0.05), 中分化组和低分化组差异有显著性(t = 2.77, P<0.05); 高分化组p21染色的色度(32.16±8.78°)、中分化组 (53.98±6.95°)、低分化组(62.32±2.32°), 高分化组和中分化组差异有显著性(t = 5.71 P<0.01), 中分化组和低分化组差异有显著性(t =9.20, P<0.01).

结论

用图像色彩的指标定量分析食管鳞癌免疫组化图像可能反应食管鳞癌的不同分化程度.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: August 24, 2002
Revised: September 20, 2002
Accepted: October 12, 2002
Published online: May 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

病理学高效率而有机地将计算机图像处理系统技术应用病理学教学与临床诊断中, 很好地适应于计算机及网络时代的要求. 定量病理学技术主要指将数学方法引入病理学观察与研究过程, 实现由传统病理学定性观察到定量研究的转变, 是近年来定量病理学技术得到长足进展的原因[1]. 在免疫组化定量分析方面, 有学者应用计算机图像分析技术进行肺癌p53免疫组化定量分析[2], 以阳性水平指数(PLI), 即阳性细胞百分比与阳性平均光密度的乘积作为定量指标[3]. 但光密度是细胞在同一光源下吸收光的数值, 不能反映切片的色彩变化, 而免疫组化阳性着色的色彩是结果判定的重要依据. 为了弥补上述不足, 我们尝试应用计算机图像分析技术对食管鳞癌p53、p21、PCNA免疫组化染色阳性细胞核的红、绿、蓝色值及色度、饱和度、灰度等描述图像色彩指标进行了定量分析, 现报告如下.

1 材料和方法

1.1 材料

35例标本来自我院1997-2002年间心胸外科收治手术切除的食管鳞癌病例, 均经病理学确诊, 高分化病例9例, 中分化病例13例, 低分化病例13例. 同时取非癌食管组织作为对照.其中男25例, 女10例, 平均年龄50岁; p53阳性25例, PCNA阳性24例, p21阳性28例. 非癌食管组织均为阴性.

1.2 方法

1.2.1 染色方法 标本经100 ml·L^-1甲醛固定, 常规石蜡包埋, 切片厚4 μm, HE染色进行组织学分类.免疫组化采用SP法. p53、PCNA及p21单抗购自SantaCruz公司, 试剂盒为北京中山公司产品. 苏木素复染. 空白对照以PBS取代一抗, 阳性对照为已知阳性片.

1.2.2 阳性判断标准 阳性染色主要位于细胞核, 呈棕黄色颗粒状, 背景清晰. 阴性对照无着色.

1.2.3 计算机图像分析 应用北京天地百年科技有限公司TD-2000真彩色病理细胞显微分析系统, 显微镜下选取阳性细胞集中的视野, 调整图像效果, 经彩色CCD摄像机将图像输入计算机病理图像分析系统, 转化为数字图像. 注意输入图像的背底灰度(即每张载玻片上没有细胞或组织区域的灰度)一致, 以消除载玻片透光度及背底灰度等的影响. 每个图像选取30个阳性细胞, 选择测量指标, 由系统自动测量相应数据.

1.2.4 描述图像色彩的指标 免疫组化染色结果的判定, 除考虑着色部位外, 主要根据着色的色彩判定. 图像色彩可根据三基色原理分解为红(R)、绿(G)、蓝(B)三种颜色. 三基色按不同比例相加合成混合色. 三基色间的比例关系, 反映图像呈现的颜色, 三基色的色值则反映该基色的强度, 这是RGB格式. Munseu提出了HSI格式, I表示灰度, 其确定了像素的整体亮度, 而不管彩色是什么. 色度(H)由角度表示, 通常规定0°彩色为红色, 120°为绿色, 240°为蓝色.饱和度(S)的概念可描述如下: 假设有一纯红的颜料, 饱和度为100%, 混入白色染料后使红色变淡, 减少了饱和度. 随着红色变得越来越淡, 饱和度降低, 最后接近于零(白色)[4]. 三基色色值与色度、饱和度、灰度的换算参阅文献[4]. 由于免疫组化染色DAB显色呈棕色, 所以在RGB格式, 阳性着色必须是红、绿色值均大于蓝色, 且差别越大阳性色彩越强. 在此基础上, 红、绿色值比较, 红色值越大阳性色彩越强. 在HSI格式, 阳性着色的色度必须<90°, 越接近于0°阳性色彩越强; 饱和度越高阳性色彩越强; 灰度色彩越强, 阳性色彩越强. 如果DAB显色后再经苏木素复染, 阳性细胞可能会着有一定的蓝色, 这就可能出现蓝色值大于绿色值的情况, 但不应大于红色值, 此时呈现品红色. 这种情况在RGB格式, 红色值必须大于蓝色值, 且红色值越大阳性色彩越强.绿色值与红、蓝色值比较, 差别越大阳性色彩越强. 转化为HSI格式则色度必须>300°且色度越大阳性色彩越强(越趋近于360°也即0°, 红色); 饱和度越高阳性色彩越强; 灰度越低阳性色彩越强.

统计学处理 将数据转化成SPSS for windows格式, 用SPSS软件进行统计分析. 采用t检验, P<0.05为差异有显著性.

2 结果

2.1 p53阳性食管鳞癌图像分析

不同分化程度的p53阳性食管鳞癌图像分析结果显示, 红、绿、蓝色值均以高分化组高于中分化组、高于低分化组(表1). 三基色的比例提示, 三组红、绿、蓝色值均依次降低, 但以低分化组更明显, 说明两组虽均呈红黄色, 但低分化组与中分化组和高分化组相比, 更偏于红色. 三组色度接近, 在45°左右, 呈橙黄色, 低分化组略低, 即较中分化组略偏橙色, 灰度以中高分化组较高, 但差异没有显著性. 饱和度以低分化组高于中分化组, 差异有非常显著性(t = 5.12, P<0.01), 中分化组高于高分化组, 差异有显著性(t = 2.31, P<0.05), 说明低分化组色彩较强[5-8].

表1 不同分化程度食管鳞癌的p53图像分析结果.

分化程度	P53阳性(n)	饱和度(%)	色度 (o)	灰度	红色度	绿色度	蓝色度
Well	7	2.15±1.21	52.21±22.34	175.08±13.21	175.15±12.02	173.12±8.80	172.85±20.42
Moderate	9	4.95±2.99	48.72±20.32	171.87±11.58	175.08±12.16	172.25±10.80	161.45±15.82
poor	9	10.95±1.81	45.32±4.74	163.92±11.85	175.02±12.62	162.45±12.40	142.38±8.52

2.2 PCNA阳性食管鳞癌图像分析

不同分化程度的PCNA阳性食管鳞癌图像分析结果显示, 红、绿色值低分化组高于中分化组、高于高分化组, 蓝色值高分化组高于中分化组、高于低分化组, 差异没有显著性(表2). 三基色的比例提示, 高分化组和中分化组红、绿色值非常接近, 蓝色值较低, 而低分化组红色值高于绿色值, 蓝色值低于绿色值, 说明虽然三组均呈红黄色, 但低分化组与中分化组和高分化组相比, 偏于红色. 三组色度在55°左右, 基本呈黄色, 以低分化组小于中分化组、小于高分化组, 即略偏于橙色, 但差异没有显著性. 灰度三组基本一致. 饱和度低分化组高于中分化组, 差异有显著性(t = 2.77, P<0.05), 中分化组高于高分化组, 差异有显著性(t = 2.24, P<0.05), 说明低分化组色彩较强[9,10].

表2 不同分化程度食管鳞癌的PCNA图像分析结果.

分化程度	PCNA阳性(n)	饱和度(%)	色度(o)	灰度	红色度	绿色度	蓝色度
Well	7	3.72±2.81	50.06±6.85	171.98±16.90	171.70±15.01	174.88±18.12	165.98±20.15
Moderate	8	7.71±3.91	57.55±6.71	173.51±14.90	175.97±13.00	175.57±15.78	156.47±17.94
poor	9	12.95±3.89	55.20±6.46	174.91±8.05	181.72±8.49	176.97±9.21	146.47±8.06

2.3 p21阳性食管鳞癌图像分析

不同分化程度的p21阳性食管鳞癌图像分析结果显示, 红、绿、蓝色值低分化组均高于中分化组?高于高分化组, 但差异没有显著性(表3). 三基色的比例提示, 高分化组和中分化组红、绿、蓝色值依次降低, 低分化组红、绿色值接近, 蓝色值较低, 说明三组虽均呈红黄色, 但高分化组和中分化组与低分化组相比, 更偏于红色. 三组色度均在60°左右, 接近黄色, 以高分化组小于中分化组小于低分化组, 说明高分化组和中分化组偏于橙色, 色度高分化组高于中分化组, 差异有非常显著性(t = 5.71, P<0.01), 中分化组高于低分化组, 差异有非常显著性(t = 9.20, P<0.01), 三组饱和度以高分化组略高, 灰度低分化组较高, 但差异没有显著性[11].

表3 不同分化程度食管鳞癌的p21图像分析结果.

分化程度	P21阳性(n)	饱和度(%)	色度 (o)	灰度	红色度	绿色度	蓝色度
Well	8	7.55±2.32	32.16±8.78	164.59±3.59	167.55±2.98	160.58±4.98	144.58±5.75
Moderate	9	7.45±2.13	53.98±6.95	167.59±5.86	169.78±5.04	165.28±6.78	147.46±7.98
poor	11	7.43±2.22	62.32±2.32	172.97±11.61	171.18±10.98	172.45±11.72	153.98±12.95

3 讨论

大量研究证明p53、p21及PCNA变化与肿瘤的发生发展密切相关. p53基因突变, 抑癌基因失控, 可以导致食管鳞癌的发生. p21基因与食管鳞癌发生发展关系亦十分密切. PCNA则常用作恶性增生的指标[12]. 目前, 病理切片免疫组化定量分析仅用阳性细胞数占肿瘤细胞的百分比即PI指数来衡量[13]. 免疫组化染色需通过病理切片的着色情况来判定结果, 由于人眼对相同强度光的主观感觉不同, 将会影响对结果的判定. 而应用计算机进行图像分析, 则可避免这种主观感觉的偏差. 有研究表明应用图像分析技术对细胞核DNA含量进行定量分析, 能较好地反映病理图像与DNA量的关系.有学者应用图像分析技术进行DNA倍体分析, 结果与流式细胞仪测定结果非常接近[14]. 亦有学者用计算机图像处理技术, 对痰涂片中巴氏染色的角化性鳞癌细胞(KSCC)、非角化性鳞癌细胞(NKSCC)和腺癌细胞(ACC)胞质进行了色度学定量分析, 结果KSCC的红、绿、蓝色值显著高于NKSCC和ACC, 且差值较大, 而灰度在各组间的差值则较小, KSCC与NKSCC, KSCC和ACC的色度差值较大, 差异极为显著, KSCC、NKSCC、ACC三组间饱和度差异显著, KSCC明显高于NKSCC和ACC, 从而认为红、绿、蓝色值、色度、饱和度等描述图像色彩指标在KSCC和NKSCC、KSCC与ACC的鉴别中有重要价值, 其分辨的敏感程度优于灰度图像分析. 我们则应用计算机图像分析技术对食管鳞癌p53、PCNA和p21免疫组化染色阳性的病理切片进行了图像分析. 免疫组化染色经DAB显色后阳性细胞呈棕色, 再经苏木素复染, 将着有一定的蓝色, 这会在一定程度上影响对染色的判定. 采用多媒体彩色图像分析系统进行定量分析, 分别测定红、绿、蓝三种颜色的色值, 可用来区分细胞对不同颜色的着色程度, 并可通过三基色色值或计算色度、饱和度、灰度来对细胞呈现的色彩进行定量描述[15-17]. 本研究结果显示, 对同一组织类型、同是免疫组化染色阳性的食管癌细胞, 一些反映着色色彩的指标在不同分化程度之间确实存在着差别, 这种差别单纯应用定性指标或形态学指标无法充分显示, 图像分析技术则可弥补这一不足.

备注

$[Footnotes]

参考文献

1.	张 桂珍, 赵 世光, 薄 立华, 崔 亚南, 刘 霆, 徐 辉. 计算机图像处理系统在病理学教学及临床诊断中的应用. 白求恩医科大学学报. 2000;26:171-173.  [PubMed]  [DOI]

2.	Kaya H, Kotiloglu E, Inanli S, Ekicioglu G, Bozkurt SU, Tutkun A, Kullu S. Prevalence of human papilloma virus(HPV)DNA in larynx and lung carcinomas. Pathologica. 2001;93:531-534.  [PubMed]  [DOI]

3.	吴 培仁, 钟 芷芬, 洪 永寿. 食管鳞癌DNA定量分析的临床意义. 中国肿瘤临床与康复. 1998;5:25-26.  [PubMed]  [DOI]

4.	孙 立新, 宋 立刚, 宋 志杰, 胡 建功, 赵 晓明, 金 小平, 李 民. 肺鳞癌免疫组化彩色图像定量分析. 中国肺癌杂志. 2001;4:216-218.  [PubMed]  [DOI]

5.	李 道堂, 石 殿鹏, 孙 兰萍, 仲 伟霞, 杨 瑞森, 罗 景玉, 王 家林, 陈 刚, 李 秀玲. p53、PCNA及VEGF表达与食管鳞癌预后的相关性研究. 肿瘤防治杂志. 2001;8:247-250.  [PubMed]  [DOI]

6.	廖 琼, 杨 霞, 孙 维纲, 廖 乘风. 食管鳞癌p53、c-erbB-2蛋白表达研究. 中国组织化学与细胞化学杂志. 2000;9:175-177.  [PubMed]  [DOI]

7.	王 永康, 陈 景寒, 孟 龙, 杜 德利, 刘 静. p53和nm23联合表达对食管鳞癌淋巴结转移的影响. 临床与实验病理学杂志. 1999;15:414-416.  [PubMed]  [DOI]

8.	陈 守惠, 洪 东旭, 叶 欣, 吴 若华, 葛 惠敏. p27和p53在食管鳞癌中的表达及其意义. 中国现代医学杂志. 2002;12:7-9.  [PubMed]  [DOI]

9.	李 淳, 程 继东, 蔡 维佳. HSP70、P 糖蛋白、PCNA在食管鳞癌中的表达. 实用癌症杂志. 1999;14:205-207.  [PubMed]  [DOI]

10.	马 福成, 张 传山, 胡 沛臻, 王 文亮. p21WAF1/CIP1与PCNA在食管鳞状细胞癌发病中的意义. 诊断病理学杂志. 2002;9:178-179.  [PubMed]  [DOI]

11.	谢 斌生, 易 建华, 杜 兴贵, 朱 礼国, 姚 俊霞. Rb、p21、MMP 2和LN R在食管鳞癌中的表达及其与侵袭和转移的关系. 实用癌症杂志. 2001;16:393-396.  [PubMed]  [DOI]

12.	Stoner GD, Gupta A. Etiology and chemoprevention of esophageal squamous cell carcinoma. Carcinogenesis. 2001;22:1737-1746.  [PubMed]  [DOI]

13.	廖 美琳, 林 振琼, 周 允中, 赵 家美, 许 凯黎. 非小细胞肺癌生物学特性检测的临床意义. 中华结核和呼吸杂志. 1998;21:30-33.  [PubMed]  [DOI]

14.	Polkowski W, Van lanschot JJ, offerhaus GJ. Barrett esophagus and cancer: pathogenesis, carcinogenesis, and diagnostic dilemmas. Histol Histopathol. 1999;14:927-944.  [PubMed]  [DOI]

15.	Walch A, Bink K, Gais P, Stangl S, Hutzler P, Aubele M, Mueller J, Hofler H, Werner M. Evaluation of c-erbB-2 overexpression and Her-2/neu gene copy number heterogeneity in Barrett's adenocarcinoma. Anal Cell Pathol. 2000;20:25-32.  [PubMed]  [DOI]

16.	Shirakawa Y, Naomoto Y, Kimura M, Kawashima R, Yamatsuji T, Tamaki T, Hamada M, Haisa M, Tanaka N. Topological analysis of p21WAF1/CIP1 expression in esophageal squamous dysplasia. Clin Cancer Res. 2000;6:541-550.  [PubMed]  [DOI]

17.	Hashimoto N, Tachibana M, Dhar DK, Yoshimura H, Nagasue N. Expression of p53 and RB proteins in squamous cell carcinoma of the esophagus: their relationship with clinicopathologic characteristics. Ann Surg Oncol. 1999;6:489-494.  [PubMed]  [DOI]