幽门螺杆菌感染者胃黏膜中内质网分子伴侣Grp94的表达

摘要

目的

探讨幽门螺杆菌感染对胃黏膜组织中内质网分子伴侣Grp94mRNA及蛋白水平表达的影响及意义.

方法

应用半定量RT-PCR方法及Western blot方法检测感染与未感染幽门螺杆菌的胃黏膜组织中Grp94 mRNA及蛋白的表达情况.

结果

未感染组28例, Grp94 mRNA表达量为0.424±0.055, 感染组32例, Grp94mRNA表达量为0.882±0.082. 两组相比感染组Grp94mRNA的表达量明显高于未感染组(P<0.01); 未感染组Grp94蛋白表达量为0.427±0.036, 感染组Grp94蛋白表达量为0.671±0.072, 两组相比感染组Grp94蛋白表达量明显高于未感染组(P<0.01).

结论

幽门螺杆菌感染可使胃黏膜增加Grp94mRNA的表达及蛋白的合成, 这可能有利于胃黏膜的自身保护作用.

关键词: N/A

Expression of glucose-regulation protein 94 in gastric mucosa infected with Helicobacter pylori

Meng-Chun Wang, Wen-Gang Fang, Jin-Ge Gu, Yan Li

Meng-Chun Wang, Center of Endoscopy, the Second Clinical Hospital, China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China

Wen-Gang Fang, Department of Development Biology, China Medical University, Shenyang 110002, Liaoning Province, China

Jin-Ge Gu, Department of Gastroenterology, the Third Hospital of Shenyang, Shenyang 110014, Liaoning Province, China

Yan Li, Department of Gastroenterology, the Second Clinical Hospital, China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China

Correspondence to: Meng-Chun Wang, Department of Gastroenterology, the Second Clinical Hospital, China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China. mengchunwang@hotmail.com

Received: October 7, 2002
Revised: October 10, 2002
Accepted: October 18, 2002
Published online: May 15, 2003

Abstract

AIM

To study the expression of glucose regulation protein 94 in gastric mucosa infected with Helicobacter pylori.

METHODS

Semi-quantitative RT-PCR method was used to demonstrate mRNA expression of Grp94 in H.pylori (Hp) infected and non-infected gastric mucosa. Western blot was used to detect the expression level of Grp94 protein in the tissues.

RESULTS

Hp negative group had 28 cases, and the expression amount of Grp94 mRNA was 0.424±0.055. Hp infected group had 32 cases and the expression amount of Grp94 mRNA was 0.882±0.082. The expression amounts of Grp94 protein were 0.427±0.036, 0.671±0.072 respectively in Hp-negative and positive groups. The expression amounts of Grp94 mRNA and Grp94 protein in infected group showed a significant increase (P<0.01) respectively.

CONCLUSION

H.pylori infection may increase the expression of Grp94 at mRNA level in gastric mucosa. Meanwhile, it also increases synthesis of the protein.

Key Words: N/A

0 引言

研究表明幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)的热休克蛋白(heat shock protein, HSP)是一种致病因子, 而人胃黏膜又是热休克反应的重要部位, 感染Hp后可产生一些热休克蛋白, 如HSP70, HSP72, HSP60等, 这些热休克蛋白的产生可能与胃黏膜自身保护作用有关. 热休克蛋白通常不参与靶蛋白的组成, 因此又被认为是一种分子伴侣(molecular chaperon), HSP作为分子伴侣可促进细胞内蛋白质的合成、折叠、装配, 与类固醇、干扰素、癌基因、细胞因子等重要生物活性物质有着密切关系, 控制着细胞的生长、发育和调节过程. Grp94(glucose regulation protein)是内质网分子伴侣家族重要成员, 参与蛋白质的折叠, 装配和转运, 主要是在新生肽链合成的早期阶段, Grp94与之形成稳定的复合物协助其折叠和装配, 他也能与尚未装配或错误折叠的蛋白质形成复合物, 同时在肿瘤细胞中具有抗原提呈作用. 但是幽门螺杆菌感染后人胃黏膜Grp94的表达及作用尚不清楚. 我们以RT-PCR及Western blot方法分别检测Grp94mRNA及蛋白水平的表达情况.

1 材料和方法

1.1 材料

胃镜检查时将除外心脑血管、肝肾疾病, 检查前2 wk未用抗生素及铋剂的患者列入本实验. 于胃镜检查时取胃窦黏膜6块, 分别用于快速尿素酶试验、Giemsa染色、RNA提取、蛋白提取. 快速尿素酶试验、Giemsa染色同时阳性为Hp感染组, 共32例, 其中浅表胃炎12例, 胃溃疡10例, 十二指肠溃疡10例. 两项检测同时阴性为Hp未感染组, 共28例, 基本正常胃黏膜10例, 浅表性胃炎8例, 胃溃疡5例, 十二指肠溃疡5例. TRIzol试剂, Gibco BRL; AMV逆转录酶, 5×buffer、RNAsin, Promega; Taq酶、dNTP、10×buffer、MgCl, Takara公司; 50×TAE琼脂糖上海生工生物制品公司; ECL试剂盒, Amerham Phamarcia; 羊抗人Grp94多克隆抗体, Santa Cruz; HRP标记马抗羊二抗, 中山公司.

1.2 方法

1.2.1 Grp94 mRNA表达的检测 胃镜下于胃窦大弯、小弯各取黏膜1块, 置于预冷的装有Trizol 200 μl的EP管中, 按Trizol试剂盒提取总RNA, 用紫外分光光度计测定RNA的纯度及浓度, 两步法RT-PCR扩增, Grp94引物参照文献[1]设计, 为校正逆转录效率及不同样品间的差异, 以β-actin为内部参照物, 在同一反应体系中与Grp94同时扩增, 以定量Grp94mRNA的表达量, 与β-actin的比值作为校正后的Grp94mRNA表达量. 反应条件: 94 ℃ 10 min后, 94 ℃变性1 min、58 ℃复性45 s、72 ℃延伸45 s, 进行30循环后, 72 ℃进行10 min延伸反应. 20 g/L琼脂糖凝胶电泳后, 在紫外灯下确认电泳带, Grp94为270 bp, β-actin为535 bp. 在凝胶成像系统分别扫描Grp94与β-actin电泳带密度, 求出二者比值, 即为Grp94mRNA表达的相对水平.

1.2.2 Grp94蛋白表达的检测 胃镜检查时于胃窦大弯、小弯各取黏膜1块, 裂解液中匀浆、低温离心, 考马斯亮蓝法定量. 含15 μg蛋白的样品在80 g/L DS-PAGE进行电泳, 半干转印仪至PVDF膜, 将PVDF膜浸入封闭液中室温过夜, 加入用杂交液按1:1000稀释的一抗, 摇床上室温杂交30 min-2 h或过夜. 加入用杂交液按1:5000稀释的二抗, 摇床杂交30 min. 将ECL试剂盒内的detection reagent 1与detectior resgent 2等体积混合后, 均匀滴在PVDF膜上, 固定于暗盒中, 曝光、洗片. 电脑扫描, Kodak1D软件系统计算Grp94的密度值及β-actin的密度值, 二者的比值作为该样品Grp94蛋白的表达量.

统计学处理 数据经Excel软件t检验处理, 以均数±标准差表示, P<0.05为有显著差异.

2 结果

Grp94 mRNA和蛋白表达量见表, 从表中可以看出Hp阳性组不同病变胃黏膜Grp94 mRNA和蛋白表达量无差异, Hp阴性组不同病变胃黏膜Grp94 mRNA和蛋白表达量无差异; Hp阳性组胃黏膜Grp94 mRNA和蛋白表达量明显高于Hp阴性组(P<0.01), 表1.

表1 Hp对不同胃黏膜组织Grp94 mRNA和蛋白表达的影响(x±s).

组别	n	Hp阳性		n	Hp阴性
		Grp94 mRNA	Grp94蛋白		Grp94 mRNA	Grp94蛋白
基本正常胃黏膜	10				0.430±0.032	0.414±0.0124
浅表胃炎(中-重度)	12	0.870±0.066	0.685±0.090	8	0.421±0.067	0.445±0.041
胃溃疡	10	0.892±0.115	0.659±0.072	5	0.403±0.072	0.127±0.047
十二指肠溃疡	10	0.887±0.050	0.667±0.342	5	0.436±0.044	0.429±0.036
合计	32	0.882±0.082	0.671±0.072	28	0.424±0.055	0.427±0.036

3 讨论

Hp本身含有HSP, 可能作为致病因子在Hp感染时发挥作用[2-9]; 而且Hp感染尚可刺激胃黏膜细胞产生不同的HSP, 在Hp相关性胃疾病中发挥不同的作用[10-17]. Grp94属于HSP90家族, 具有50%的同源性, 因此享有HSP90家族的一些特性, 是内质网标志分子伴侣, 也具有多种重要的生物学功能[18,19], 如分子伴侣特性、维持体内Ca⁺²的平衡, Mg+2依赖性的ATPase活性、C^a+2、Mg⁺²依赖性自身磷酸化作用以及Mg+2依赖性的丝氨酸激酶活性等.

我们从mRNA水平及蛋白水平分别检测了感染Hp后胃黏膜组织中Grp94的表达, 结果表明, Grp94在胃黏膜有基础表达, Hp感染组Grp94 mRNA及蛋白的表达均明显高于Hp未感染组, Hp感染组与未感染组不同胃黏膜病变中的表达无差异性, 提示胃黏膜Grp94表达的增加可能与Hp感染有关, 而与胃黏膜的炎症程度无关. 我们推测, 胃黏膜感染Hp后, 在Hp各种致病因子的作用下, 胃黏膜上皮细胞的微环境发生一系列的变化(如局部pH值的改变、细胞内蛋白质构型的改变等), 从而启动了胃黏膜的应激反应, 激活热休克基因, 编码Grp94, 增加了内质网合成Grp94. Grp94作为内质网标志分子伴侣主要参与蛋白质的折叠, 装配和转运[20-23], 是在新生肽链合成的早期阶段, Grp94与新生肽链形成稳定的复合物协助其折叠和装配, 并可与尚未装配或错误折叠的蛋白质形成复合物, 从而避免错误折叠的蛋白质的合成. Hp感染胃黏膜后, 胃黏膜上皮细胞内可能出现大量变性和错误折叠的蛋白质, 而增加了的Grp94可能协助这些变性的、错误折叠的蛋白质恢复正常的折叠和装配, 从而减少黏膜细胞的进一步损伤. 但Hp感染后胃黏膜上皮细胞内哪些蛋白发生了错误折叠、Grp94的靶蛋白又是哪些有待于今后深入研究, 这些研究结果将对Hp感染的预防和治疗有重要意义.

备注

$[Footnotes]

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