修回日期: 2002-12-15
接受日期: 2002-12-28
在线出版日期: 2003-02-15
基因疫苗已成为疫苗研究领域中的热点之一, 特别是其研究方向与世界卫生组织儿童免疫长远目标-用一种疫苗预防多种疾病相吻合. 从效力到成本的潜在优点已使基因疫苗成为今后疫苗制造的选择, 故澳大利亚昆士兰医学所的Waine和McManus在《Parasitology Today》上论证, 基因疫苗为第三次疫苗革命. 令人鼓舞的是艾滋病和T细胞淋巴瘤的基因疫苗已进入到了临床前阶段. 基因疫苗不仅能预防某些传染病, 还可做为治疗用疫苗来治疗一些复杂难治的疾病, 例如病毒性肝炎、癌症等. 这些均已显示出基因疫苗的巨大潜力和应用前景. 但是, 基因疫苗的历史毕竟很短, 实验结果均来自动物, 在用于人体之前还有许多工作必须完成, 其中最重要的是解决基因疫苗对人体的安全性和效力问题, 例如: (1)须用与人类疾病相关的动物模型证实其效果; (2)须用高度敏感的PCR技术等确证所注射的DNA不与宿主细胞基因组DNA整合, 这是确保DNA疫苗遗传学安全性的重要指标之一; (3)最终还需要近期和长期的临床试验以明确其毒副作用和免疫保护效果. 我国已制定了基因转移治疗的管理条例, 基因免疫作为预防性基因治疗技术, 同样应遵守此条例, 这样才有利于基因治疗的健康发展.
引文著录: 聂青和. 基因疫苗的基础研究及应用现状. 世界华人消化杂志 2003; 11(2): 125-129
Revised: December 15, 2002
Accepted: December 28, 2002
Published online: February 15, 2003
N/A
- Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2003; 11(2): 125-129
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v11/i2/125.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v11.i2.125
许多传染病的控制、预防及治疗, 近代医学发展中最辉煌的篇章. 天花已经根绝, 伤寒、结核、白喉、麻疹、骨髓灰质炎、乙型及丙型病毒性肝炎等的发病率和死亡率明显降低. 这些医学成就从很大程度上应归功于疫(菌)苗的研制及预防接种的普及. 与传染病抗争最有效和最全面的方法是免疫接种, 这种制剂被称之为疫苗. 疫苗的研究历史是短暂的, 可划分为三代: 第一代是灭活、减毒或无毒的完整病原体(整株疫苗); 第二代是病原体的蛋白、多糖或脂质等结构成分(成分疫苗); 第三代是以接种的核酸(DAN或RNA)既是载体, 又是抗原的来源, 具有疫苗的功能, 可称为基因疫苗或核酸疫苗. 基因疫苗最新定义为能够编码某种特异性抗原并在人体或动0物体细胞内表达这种抗原的DNA或RNA等. 因DNA分子较RNA分子小、性质稳定、可操作性强, 所以, 目前研究最多的是DNA疫苗, 由于此疫苗不需任何化学载体, 故又称为裸露DNA疫苗(naked DNA vaccine).
传统上用于预防传染病的疫苗有减毒知疫苗的灭活疫苗. 前者如未充分减毒, 可使接种者发生临床型感染; 而过分灭活或减毒的疫苗有可能不能够有效刺激宿主的免疫应答, 难以获得可靠的免疫防护. 故而人们迫切希望找到一种新的安全有效的疫苗.
1990年Wolff et al试图用注射方法促使小鼠的肌细胞吸收质粒DNA以产生新的蛋白质. 对照组在注射DNA时未加任何化学佐剂, 出人意料的是对照组动物的肌细胞吸收了这种裸露的质粒DNA后, 能高水平地表达外源蛋白. Tang et al于1992年将人生长激素基因的质粒DNA导入小鼠表皮细胞后, 在小鼠血清中可检测到特异的抗人生长激素抗体, 从而提出基因免疫的概念. 随后人们在鱼、鸡、大鼠、兔、猪、牛、雪貂、猴和黑猩猩的骨骼肌以及大鼠的心肌中注射裸露DNA, 均能观察到外源蛋白的持续表达. 而且在部分研究中证实, 此途径引起的免疫应答对野生病毒的攻击具有保护作用. 这此研究表明, 直接给动物接种编码抗原的基因片段可使该动物获得对该抗原的免疫力, 即将编码某种蛋白的处源基因直接导入动物细胞可达到免疫接种的目的. 这一基因免疫接技术的出现, 为新型疫苗的研制开路了一条崭新途径. 所接种的核酸(DNA或RNA)既是载体, 又是抗原的来源, 具有疫苗的功能, 可称为基因疫苗或核酸疫苗.
基因疫苗一般由病原体抗原编码基因和以真核细胞作为表达载体的质粒构成. 抗原编码基因可以是完整的一组基因或单个基因的cDNA; 也可以是编码抗原决定簇的一段核酸序列. 总之, 其表达产物为病原体的有效抗原成分, 可引起保护性免疫. 载体质粒多以pBR322或pUC质粒为基本骨架, 带有细菌复制子(ori), 能在大肠杆菌内高效稳定的复制, 但缺乏在哺乳动物细胞内复制的能力. 质粒载体所带启动子多来源于病毒基因组, 如CMV、RSV和鼠白血病病毒长臂末端重复序列(LTR)等启动子. 此类启动子具有较强的转录激活作用, 能保证抗原基因在真核细胞内有效表达并引起免疫应答.
基因疫苗激活免疫系统的详细机制尚不十分清楚. 一般认为, 含病原体抗原基因的核酸疫苗被导入宿主骨骼肌细胞或皮肤细胞后, 可在细胞内表达病原体的蛋白质抗原, 经加工后形成的多肽抗原可与宿主细胞MHCⅠ类和Ⅱ类分子结合, 并被提呈给宿主的免疫识别系统, 从而可引起特异性体液和细胞免疫应答. 肌细胞吸收和表达处源DNA的效力较高, 这可能与肌细胞本身的结构特点有关. 肌细胞可形成多核细胞, 含有肌质网; 骨骼肌和心肌还具有T小管系统, 该系统含有细胞外液并能伸入到细胞内部. Wolff et al发现组织培养的肌细胞T小管和细胞膜穴样内陷可将质粒纳入. Vahlsing et al认为, 肌细胞可能作为一种中心成分直接参与诱导免疫应答. 例如, 流感病毒NP基因只有在肌细胞内表达并分泌到胞外, 才能刺激机体产生抗-NP抗体, 介导体液免疫应答; 而经肌细胞蛋白酶加工处理后的NP则可在MHCⅠ类分子的限制下提呈给T淋巴细胞, 导致体内CTL应答. 所需刺激信号来源于肌细胞本身, 或者来源于注射引起的损伤区域的浸润细胞. 另一种观点是, 肌细胞的直接参与并非必需, NP从肌细胞分泌出来后, 被巨噬细胞和(或)树突状细胞吞噬、处理、提呈、分别在MHCⅠ和Ⅱ类分子的限制下, 诱导CTL前体、B细胞和特异性Th细胞. 还有一种解释是用DNA免疫时, 肌细胞和抗原呈细胞(APCs)均被转染, 引起CD4＋、CD8＋T细胞亚群的同时活化, 从而产生特异性细胞免疫应答.
3.1.1骨骼肌细胞在基因疫苗接种中的作用: 骨骼肌细胞能够摄取注入其周围的质粒DNA, 使通过肌肉注射进行基因疫苗接种的方法显得颇为简单、直接. 据报道, 局部肌肉注射丁哌卡因或心脏毒素可导肌肉组织损伤, 肌纤维在自损伤逐步恢复的过程中对质粒DNA的摄取会增加, 因此有时可借助这种现象提高基因疫苗的接种效率. 但是肌组织并非免疫相关组织, 因为肌细胞不具有APCs的特征, 不表达MHC-Ⅱ限制性抗原和各种免疫识别所需的共刺激分子(costimulatory-molecules), 不能分泌相应的细胞因子(cytokines); 即使有相关共刺激分子的表达或存在粒巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素12(IL-12)等细胞因子的作用, 非造血干细胞也不能转变为有效的APCs细胞. 成纤维细胞等非职业性APCs虽能在体内成功地将抗原呈递给幼稚T细胞, 但这些抗原仅限于那些具有足够的免疫原性、能够克服共刺激分子缺乏的病毒抗原. 此外, 有一项研究显示, 如果肌注质粒DNA后10 min内将注射部位的肌肉切除, 并不明显影响针对特异抗原的抗体免疫应答的程度和持续时间, 进一步表明在通过肌肉注射途径进行基因疫苗接种时, 肌细胞本身对免疫应答并不具有十分重要的作用, 亦即肌细胞本身并不参与免疫激活的过程, 而只是起一种抗原或基因疫苗运送转站的作用. 确实, 注射疫苗的肌肉部位也并无明显的炎性细胞浸润, 特别是在疫苗接种后的急性效应相消失后. 肌肉注射基因疫苗之所以可以启动免疫应答, 可能有几个方面的机制: (1)肌细胞是抗原贮存库, 可向专业APCs提供全长蛋白或多肽以诱导免疫应答; (2)处于肌纤维间隔而未被肌细胞摄取质粒DNA也可因穿刺操作进入血液循环而直接被流经局部的APCs摄取, 并在APCs内表达; 在上述两种情况下, 表达抗原的髓源性APCs随血流迁移人淋巴结组织, 在此处激活T淋细胞和B淋巴细胞; (3)由于表达疫苗抗原的肌细胞易于被CTLs攻击和破坏, 因此其中的质粒DNA可释放入血而持续转染包括单核-巨噬细胞在内的APCs.
3.1.2 髓源性APCs在基因疫苗接种中的作用: 骨髓重建技术显示髓源性APCs(bone marrow-derived APCs, BM-APCs)在基因疫苗的致免疫机制中具有关键性作用. 已观察到携带有质粒疫苗的巨噬细胞自注射部位的肌组织迁移至淋巴结, 并在被免疫动物的区域淋巴结和脾脏中发现少量疫苗质粒. 基因枪接种后可在局部淋巴结中观察到被转染的树突状细胞; 如果在体外将转染有基因疫苗的树突状细胞选择性耗竭, 再将未被转染的APCs回输入动物体内, 则不能诱导T细胞活化. 树突状细胞不仅对以质粒DNA为基础的疫苗接种极为重要, 对重组病毒疫苗等顺利发挥活性也十分关键. 此外, 研究显示应用在体外能发挥最大表达活性的启动子未必能在体内诱生最强的免疫应答, 但如果使用一种在树突状细胞内具有较高活性启动子, 则可以达到较理想的免疫效果, 因此基因疫苗的改建优化应以树突状细胞为基础.
近年来发现卡介苗(BCG)具有一定的抗肿瘤活性, 表现在可激活NK细胞、诱导Ⅰ和Ⅱ型IFN的产生等, 而用DNA酶(DNAase)处理则可使之丧失这种活性. 进一步分析发现其基因组某些区域富含5′......GACGTC...3′、5′...AGCGCT...3′、5′...AACGTT...3′等回文结构, 而且每一种这样的序列中均含有5′...CpG...3′两个碱基. 以后又发现原核生物基因组中几乎平均每16个碱基中就出现一个5′...CpG...3′, 且胞嘧啶甲基化者高达70%-90%. 现已基本明确原核生物基因中这种富含5′...CpG...3′且胞嘧啶不被甲基化的序列是一种免疫增强序列(ISS), 体外人工合成含有这种序列的寡核苷酸片段(CpG-oligodeoxyonucleotides CpG-ODN)也具有免疫佐剂活性; 这种5′...CpG...3′基序(motif)可诱导B细胞增生和合成免疫球蛋白, 刺激IL-6、IFN-γ, IL-12、IL-18等分泌, 其中IL-8又能诱导NK细胞产生IFN, 这些均有助于应答向Thl型发展. ISS在体内外均可激活皮肤来源的树突状细胞, 提示其可能有助于质粒疫苗发挥效应. ISS具有完全弗氏佐剂的作用, 而且对宿主无明显毒性. 在基因疫苗接种时, ISS可以寡核苷酸的形式与质粒DNA同时应用, 也可以在质粒骨架中增加ISS的数量以提高质粒疫苗的免疫效果. 对于ISS是否具有种属特异性, 其CpG-ODN中心以外的序列对活性限制性如何, 目前尚不清楚.
使用基于病毒的可表达某种抗原的同一基因疫苗重复接种(homologous boostimg), 其缺点之一在于可刺激宿主产生针对疫苗载体的回忆反应, 这种回忆反应可以破坏再次进入体内的基因疫苗, 从而降低其免疫效果. "异载体疫苗'致敏强化'接种方案(heterologous prime-boost-regimens)"则克服了这种缺点. 该方案采用表达同一抗原但载体不同的基因疫苗先后进行接种, 即在初期接种采用抗原性虽然较高但能高效表达编码抗原的、结构较复杂的载体. 这种接种方案不仅可克服宿主回忆反应对接种效果的影响, 而且可使免疫应答向Th1型方向发展, 即使是在重组蛋白已启动了Th2型免疫应答的情况下. 应用Pbergheei疟疾模型研究显示, 先用质粒载体、继用重组牛痘病毒载体接种的这种"异载体同抗原免疫接种法"有利于产生完全保护, 而"同载体同抗原免疫接种法"收效甚微. 动物实验还证实, 先后分别用基因枪、牛痘病毒、鸟痘病毒将某一种肿瘤抗原接种动物, 可显著提高免疫应答. 这种先用简单载体(如质粒DNA)继用复杂载体(如牛痘病毒)携带抗原进行免疫接种方案之所以能取得相对理想的结果, 可能有以下原因: (1)病毒本身的表达产物, 如可溶性分泌性细胞因子受体类似物, 有可能干扰初次接种的效果, 对弱抗原尤其如此; (2)来自病毒载体的表位较之所携带的弱抗原可能具有免疫优势, 在初次免疫时阻碍针对弱抗原的免疫应答并进而削弱加强阶段的免疫应答; 但如果初次接种时应用质粒DNA载体避免这种干扰, 则在加强接种时由于针对弱抗原的免疫已得到放大, 这种病毒表位免疫优势的影响就相对较小; (3)人体可能存在对某些病毒载体的免疫性, 增加了应用这些载体进行接种时免疫结果的复杂性.
理论上, 不论宿主的体积大小, 一定剂量的基因疫苗均有可能有效诱发特异性免疫应答. 但目前各家报道的结果不相一致, 难以进行比较. 因为许多因素均可影响免疫应答的程度和类型. 以质粒DNA为例, 表1概括了影响其效果的主要因素.
| 影响因素 | 评论或可供解决的方案 |
| 质粒DNA骨架的结构 | 引入免疫促进性序列或聚腺苷(polyA)序列等将有助于提高免疫效果 |
| 导入质粒DNA的剂量 | 一般越多越好 |
| 抗原的表达水平 | 应使用高效表达抗原的载体;表达的抗 原越多,免疫应答的程度越强,尽管未必 呈现线性关系 |
| 接种间隔 | 确定各次接种间的合适时间间隔可以大大提高免疫效果 |
| 接种途径 | 合理选择接种方法,如肌肉或皮内注射、基因枪皮肤接种、黏膜接种等 |
| 接种的靶组织 | 不同的接种部位效果不同 |
| 接种次数 | 必须保证足够的次数 |
| 报告基因前是否存在内含子 | 有内含子存在时可以提高接种效果 |
| 接种对象的种类 | 如不同株的小鼠对DNA疫苗的反应性有质和量的差别 |
| 接种对象的年龄 | 较年轻的小鼠免疫应答能力较强 |
| 特异性抗原对被 | 毒性抗原的表达不宜过高 |
| 转染细胞的毒性 |
基因疫苗与传统疫苗相比, 具有以下特点: (1)直接DNA接种: 避免了制备传统疫苗的繁琐过程; (2)基因疫苗接种后蛋白质抗原可直接与MHCⅠ类和Ⅱ类分子结合形成免疫复合物, 与减毒活疫苗或载体活疫苗一样能引起CTL反应, 但不存在后者的毒力回升等危险; (3)基因免疫时产生的抗原多肽的提呈过程和自然感染时相似, 以其天然构象被提呈给免疫识别系统, 此一特性对于构象型抗原表位引起的保护性免疫尤为重要, 而用目前的重组技术在体外合成的蛋白抗原常造成构象型抗原表位的改变或丢失; (4)基因疫苗具有共同的理化性质为联合免疫提供了可能; (5)作为一种重组质粒, 基因疫苗能在大肠菌工程菌内快速增生, 且提取纯化简便, 可大幅度降低成本, 省时省力; (6)可以同种异株交叉保护. 选择某一种病原体的编码保守蛋白的核酸序列作为基因疫苗, 因其不会变异, 故可对同一种病原体的变异型或新型产生交叉免疫, 从而起到免疫保护作用. 这是基因疫苗突出的优点之一. (7)受宿主预存免疫性(pre-existing immunity)的影响很小, 这是基因疫苗无可比拟的优点之一; (8)基因疫苗不仅可用于预防, 还可用于治疗.
基因疫苗的安全性是人们关心的重要问题. 在理论上存在导入的外源DNA整合入宿主细胞基因组的可能, 并导致细胞癌基因的顺式或反式激活、抗癌基因的失活等, 使细胞发生恶性转化. 但通过甲基化分析、酶切分析和PCR等技术的研究结果表明, 进入骨骼肌细胞的DNA分子独立存在于细胞质中, 未发现复制或整合. 另一问题是有可能引起抗-DNA抗体和自身免疫性疾病. 但Robertson最近研究表明, 裸露的双链DNA分子很难引起抗-DNA抗体反应. 然而, 正如Spier (1995年)指出的那样, 我们对基因免疫的机制还远未了解, 其安全性有待进一步验证, 今后的道路还很长.
目前, 对兽用和人用DNA疫苗的研究日益深入, 表2列出已在动物中进行DNA疫苗防治试验的病原体. 现就几种重要的人用DNA疫苗的研究现状介绍如下.
| 病毒类 | 鸟流感病毒、牛疱疹病毒、牛病毒性腹泻病毒、登革热病毒、脑炎病毒、猫免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒-Ⅰ型、人流感病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、麻疹病毒、人乳头状瘤病毒、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、猴免疫缺陷病毒、猴病毒40(SV40)等 |
| 细菌类 | 结核杆菌、牛嗜血杆菌、沙门菌、破伤风杆菌、Burgdorferi疏螺旋体(lyme病病原体)、支原体、立克次体等 |
| 寄生虫类 | 隐孢子虫、利什曼原虫、疟原虫、血吸虫等 |
| 真菌类 | 球孢子菌、新型隐球菌等 |
1993年Robinson et al直接将编码流感病毒血凝素(HA)的DNA肌注小鸡和小鼠, 结果这些动物产生了抗HA特异性抗体并能抵抗嗣后致死剂量流感病毒的攻击. 后来其用DNA滴鼻接种, 能诱导呼吸道黏膜抗病毒的免疫保护作用.
甲型流感病毒经常发生变异, 从而逃避免疫系统的监视, 使原有的疫苗对新毒株不起作用. 1993年Merck研究室的Ulmer et al选择甲型流感病毒中序列保守的核蛋白(NP)基因制备DNA疫苗. 将高度保守的流感病毒A/PR/8/34株的NP编码基因接种在Rous肉瘤病毒或CMV的启动子的控制下. 将质粒直接注射BALB/C小鼠四头肌后, NP基因在小鼠内转录成mRNA后表达NP蛋白. 在致死剂量同型病毒异源毒株A/HK/68或A/PR/8/34株(两株为不同亚型, 分离时间相隔34 a)的攻击下, 免疫小鼠的存活率为90%, 而注射空白载体(无NP序列)的小鼠存活率为0, 未注射的小鼠存活率为20%. 经纯化的NP蛋白免疫后产生抗-NP蛋白抗体的小鼠以及输入高效价的抗NP抗体小鼠, 均不能抵抗病毒攻击, 说明抗-NP蛋白抗体介导的体液免疫无效, 而CTL介导的细胞免疫则能防御动物感染流感病毒, 可见基因疫苗的作用机制与传统疫苗不同: 编码NP的外源DNA在宿主细胞内表达, 可产生NP蛋白, 经加工处理后与MHCⅠ类分子形成复合物, 提呈到细胞表面, CTL能加以识别并发挥杀伤作用. 此种疫苗可抵抗发生显著变异的各型甲型流感病毒.
1993年Wistar研究所的科学家给小鼠和非人灵长类动物的肌肉注射含有HIV-1包膜蛋白(env)基因的质粒PM160, 结果产生了抗HIV-1(env)的特异性抗体, 他能中和HIV-1的感染, 在体外能抑制HIV-1介导的合胞体形成以及CD4与gp120结合. 同时还观察到特异性T细胞和CTL应答, 表明HLV-1 env DNA可在宿主肌细胞内表达和加工. 表达产物gp160被切割成gp120和gp41后, 可折叠成天然结构, 从而诱导全面的免疫反应. 诱生的特异性抗体不仅可与gp120和gp41结合, 还能与tat、tev基因产物反应, 这是mRNA发生剪接的结果.
美国Agracetus公司正在非人灵长类动物中试验HIV和猿猴免疫缺陷症病毒(SIV)gp120亚单位疫苗, 预计进入人体试验至少还需1 a. 质粒DNAgp120和重组DNAgP120不同, 后者为细胞外传递, 而前者由细胞内表达产生. 因此, 虽然gp120疫苗在其他系统中效果不佳, 但其DNA疫苗可能有效. 研制艾滋病疫苗的最大障碍之一就是HIV是一种变异率极高的RNA病毒, 对某些HIV株有效的疫苗对同时大量存在的变异株可能完全无效. 上述流感疫苗的研究结果给艾滋疫苗的研究提供了一条新思路, HIV包膜蛋白变异性很大, 这与流感病毒相似, 但其核心蛋白高度保守. 因此, 通过基因疫苗方法将HIV-C cDNA导入体内, 表达C蛋白后, 借助CTL介导的细胞免疫, 能否预防HIV感染, 颇值得探索. 同理, 也为目前面临困境的丙型肝炎疫苗研制提供一条新思路, 具有一定指导意义.
狂犬病病毒(RV)糖蛋白与RV的致病性有关, 又可诱生保护性中和抗体. 1994年Xiang et al将编码RV糖蛋白的cDNA插入质粒DNA, 在AV40早期启动控制下表达. 用该质粒CAN直接注射小鼠腓肠肌, 免疫3次, 间隔2-3 wk, 150 mg/次, 免疫后小鼠产生了抗-PN中和抗体、抗-PV糖蛋白特异性CTL和分泌淋巴因子的Th细胞, 末次免疫后2 wk用半数致死量(LD50)病毒标准株(CVS)攻击, 结果均获得完全保护; 而用空白载体质粒免疫的对照组在相同剂量攻击下14 d内全部死亡.
由于HBV变异及宿主免疫耐受等因素, 使乙肝疫苗接种可能失败, 给乙肝预防带来困难. 基因疫茵能否解决这些问题, 值得研究. Davis和Whalen已在小鼠中证明含编码HBsAg及preS基因并有真核细胞启动子的重组质粒DNA免疫, 可诱生抗-HBS和致敏CTL产生. 最近, 在黑猩猩中进行的实验说明, 用2 mg裸DNA作肌肉注射, 一次免疫力后即可诱生抗HBs达100 mIU/mL. 再刺激后, 抗-HBsm效价可达14 000 mIU/mL然而仅用400 mg 的HBV-DNA免疫则一次免疫后未能测出抗-HBs, 如再刺激后, 则仅有60 mIU/mL, 而且抗-HBs持续时间短暂. 实验结果提示, 这种疫苗不仅可预防HBV感染, 而且极可能发展为可供治疗乙肝患者的治疗用疫苗.
最近Kriesel et al将编码HSV-2型gD2和pRSVmt免疫DALB/c小鼠, 13 d后用半数致死量的HSV攻击, 获得满意结果, 而对照组的小鼠均先后死亡, 表明单纯疱疹DNA疫苗对动物有保护性作用.
麻风杆菌中Mr为65 kD的热休克蛋白具有高度保守性, 他与结核杆菌的抗原非常相似, 单独以该抗原免疫即可获得有效的保护作用. 1994年Lowrie et al以含该基因的质粒DNA肌注免疫小鼠用结核杆菌感染, 然后检查肝脏内的活菌数, 结果表明, 裸露DNA免疫与常规卡介苗有相似的保护作用.
1994年Sedegah et al构建的质粒DNA中含有编码尤氏疟原虫环子孢子蛋白(PyCSP)的基因. 该疫苗与目前试验中的疫苗(辐射处理的子孢子)相比, 能诱导更高水平的抗-PyCSP抗体和CTL, 并使16只免疫小鼠中的9只获得了对疟原虫感染的防御作用. 最近研究表明疟疾基因疫苗有可能成为最早用于人类的基因疫苗.
真菌在自然界广泛存在, 但临床上所见到的严重真菌感染者多有自身免疫功能不同程度的缺陷或抑制. 近些年来, 由于皮质激素、广谱抗生素、免疫抑制剂的广泛应用, 导管插管、腹膜透析、放疗等侵入性诊疗操作大量开展以及艾滋病的出现, 使深部真菌病日益多见. 目前认为治疗真菌除了抗真菌药外, 还需使机体处于高免疫状态. 基于这种情况, 真菌疫苗的研制工作显得格外重要, 也是近年来基因疫苗研究活跃的领域之一. (1)球孢子菌DNA疫苗: 球孢子菌可通过被吸入其分生孢子途径感染人体, 引起球孢子菌病. 大多数可以在宿主体内刺激免疫反应, 能有效控制疾病进展, 对再次感染提供持久的保护作用, 因此疫苗的研制很重要, 他可能提供与自然的获得性感染相同的保护作用. 研究证实, 抗球孢子感染主要依赖T细胞介导的免疫. 几种候选疫苗如PRAcDNA 、疫苗Ag2cDNA、疫苗UTEcDNA疫苗等已被发现可用于抗实验小鼠球孢子菌感染. (2)副球孢子菌DNA疫苗: 副球孢子菌是一种二态的真菌, 可引起副球孢子菌病(PCM), 主要通过吸入副球孢子菌繁殖体引起, 慢性感染常易累及肺部. 实验性的和临床证据表明, 宿主体内的细胞免疫比体液免疫能更有效地抵抗和控制副球孢子菌的感染, 也表明削弱DTH反应与疾病严重程度之间的关系. 研究显示, 副球孢子菌象其他的真菌一样, 细胞介导的免疫是最主要的防御机制. (3)两种可能用于DNA免疫的基因: 新型隐球菌是一种具有荚膜的酵母样真菌, 主要引起艾滋病及一些免疫功能低下的患者并发隐球菌病, 最常侵犯中枢神经系统, 已成为艾滋病患者并发致死性脑膜炎的主要病因之一. 早期的研究证实, 形成荚膜是新型隐球菌主要的毒力因素之一. Alejandra et al于2000年研究发现, 从隐球菌培养滤液中分离出的一种DHAl基因产物与DTH反应有关. DHAl基因可以激发DTH反应. 如果这种DTH反应与保护作用有关, 那么DHAl基因可以用于DNA疫苗的研制. Levitz et al于2001年报道用新型隐球菌的CD4+T细胞杂交瘤免疫C57BL/6小鼠, 发现一种刺激CD4细胞杂交瘤的隐球菌基因, 该基因可以编码一种98 kD的蛋白, 命名为MP98, MP98可刺激T细胞应答. 该基因已被克隆测序, 因其基因产物可刺激T细胞应答, 所以编码MPR的基因有可能用于研制DNA疫苗.
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