山莨菪碱对肝脏缺血再灌注后氧自由基的影响

doi:10.11569/wcjd.v11.i1.82

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本文章的期刊信息

出版物名称

世界华人消化杂志

ISSN

1009-3079

本文章的出版商

Baishideng Publishing Group Inc, 7041 Koll Center Parkway, Suite 160, Pleasanton, CA 94566, USA

研究快报 Open Access

世界华人消化杂志. 2003-01-15; 11(1): 82-84
在线出版日期: 2003-01-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i1.82

山莨菪碱对肝脏缺血再灌注后氧自由基的影响

董满库, 崔彦, 周立艳, 施靖华, 王强, 王平, 吉敏, 李晓鸥

董满库, 崔彦, 周立艳, 王平, 吉敏, 李晓鸥, 中国人民解放军第306医院肝胆外科北京市 100101

施靖华, 王强, 中国人民解放军第二军医大学附属长征医院上海市 200003

通讯作者: 董满库, 100101, 北京市安翔北里9号, 中国人民解放军第306医院肝胆外科. cuiyan@public.fhnet.cn.net

收稿日期: 2002-09-13
修回日期: 2002-09-20
接受日期: 2002-10-03
在线出版日期: 2003-01-15

摘要

目的: 探讨山莨菪碱对肝脏缺血再灌注后氧自由基的影响作用.

方法: 选用♂Wistar大鼠160只, 随机分为正常对照组、缺血再灌注组、生理盐水组和山莨菪碱组, 观察了肝脏缺血60 min再灌注1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h后血浆和/或肝组织中内皮素-1(ET-1)、谷丙转氨酶(ALT)、丙二醛(MDA)和再灌注1h后肝细胞内游离Ca²⁺[Ca²⁺]i)含量变化以及肝组织病理学变化.

结果: 肝脏缺血再灌注后血浆和/或肝组织中ET-1、ALT、MDA和肝细胞内[Ca²⁺]i含量均显著升高. 肝脏缺血再灌注前应用山莨菪碱后, 肝细胞内[Ca²⁺]i含量明显降低, 肝组织中MDA也有不同程度的降低, 同时肝酶的漏出减少, 肝组织病理学损害明显减轻.

结论: 山莨菪碱可以减少肝脏缺血再灌注后氧自由基的生成, 对肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用.

关键词: N/A

引文著录: 董满库, 崔彦, 周立艳, 施靖华, 王强, 王平, 吉敏, 李晓鸥. 山莨菪碱对肝脏缺血再灌注后氧自由基的影响. 世界华人消化杂志 2003; 11(1): 82-84

N/A

Correspondence to: N/A

Received: September 13, 2002
Revised: September 20, 2002
Accepted: October 3, 2002
Published online: January 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2003; 11(1): 82-84
URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v11/i1/82.htm
DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v11.i1.82

0 引言

肝脏缺血再灌注损伤是肝脏和创伤外科疾病中常见的病理过程, 许多疾病均涉及到这一过程, 如严重的肝外伤、广泛的肝叶切除、肝移植以及休克、感染等. 导致肝脏缺血再灌注损伤的原因众多, 机制复杂. 研究发现, 氧自由基在肝脏缺血再灌注损伤中起了重要作用[1-5], 我们在实验中选用山莨菪碱, 以探讨其对肝脏缺血再灌注后氧自由基生成的影响及其作用机制.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物与试剂: 本实验选用♂Wistar大鼠, 重约210-250 g, 由第二军医大学实验动物中心提供; ET-1试剂盒由解放军总医院东亚免疫技术研究所提供; MDA试剂盒由南京建成生物工程研究所提供; Fura-2/AM, Triton-x-100和EGTA购自美国sigma公司; 山莨菪碱由江苏连云港东风制药总厂提供.

1.1.2 动物模型制作及分组: 实验动物术前12 h禁食, 自由进水, 以3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔内注射麻醉, 取上腹正中切口, 显露第一肝门部, 按Nauta et al[6]的方法制作肝脏缺血再灌注模型(此模型可造成约70%的肝脏缺血, 但不影响门静脉血液回流). 动物随机分为4组: (1)正常对照组(A组): 只行假手术; (2)缺血再灌注组(B组) : 阻断入肝血流60 min后松开无创动脉夹, 恢复入肝血流, 于所需时相点处死动物取材; (3)生理盐水组(C组): 阻断入肝血流前10 min自尾静脉注射生理盐水1 mL, 其他同B组; (4)山莨菪碱组(D组): 阻断入肝血流前自尾静脉注射稀释成1 mL的山莨菪碱约0.5 mg(2.0 mg/kg), 其余同B组.

1.2 方法

1.2.1 血浆和肝组织中ET-1含量的测定: 血浆ET-1含量的测定: 采取血液约1 mL, 加入10 ul 10%EDTA二钠和20 mL抑肽酶, 混匀, 4 ℃ 3 000 rpm离心10 min, 取上清液于-70 ℃保存. 肝组织中ET-1含量的测定: 切取活肝组织约100 mg, 加入1 mL 1 mmol HCl碾磨, 随后置于100 ℃水浴10 min, 匀浆, 4 ℃ 3 000 rpm离心10 min, 取上清液于-70℃保存. 测定前将标本置于冷水中复融, 再次离心, 取上清液按ET-1试剂盒说明书所述方法用放射免疫法测定血浆和肝组织中ET-1含量.

1.2.2 肝组织中MDA含量的测定: 切取活肝组织约100 mg, 加入1 mL 1 mmol HCl碾磨, 随后置于100 ℃水浴10 min, 匀浆, 4 ℃ 3 000 rpm离心10 min, 取上清液于-70℃保存. 测定前将标本置于冷水中复融, 再次离心, 取上清液, 按MDA试剂盒说明书所述方法用硫代巴比妥酸比色法测定肝组织中MDA含量.

1.2.3 肝细胞内[Ca²⁺]i含量的测定: 将新鲜肝组织制成细胞悬液, 浓度调至1×10⁹/L, 离心去上清液, 加Fura-2/AM及适量负载液, 混均, 置于37 ℃水浴中共温浴45 min, 并持续均匀轻振, 使Fura-2/AM进入细胞内并充分反应. 温浴后离心去上清液, 用悬浮液(负载液中加CaCl₂)冲洗2次, 然后再加适量悬浮液, 保持37 ℃ 1 h内测完. 将样品移入10 nm石英比色池内, 设定激发光栅5 nm, 发射光栅10 nm, 发射波长500 nm, 以300 -500 nm激发光谱扫描测定荧光值F; 加Triton-x-100(1 g/L)破坏细胞膜, 测定Fmax; 再加EGTA(6 mmol/L)测定Fmin. 结果计算: [Ca²⁺]i = kd×(F-Fmin)/(Fmax-F), 其中kd是Fura-2和Ca²⁺反应的解离常数, 为314 nmol/L.

1.2.4 血浆ALT含量的测定: 血浆ALT含量用常规生化方法测定.

1.3 肝组织病理学变化的观察

采取新鲜肝组织用质量浓度为100 g/L的甲醛溶液固定24 h, 按病理学常规制片, H-E染色, 光学显微镜观察.

统计学处理 实验所得数据用均数±标准差(mean±SD)表示, 组间比较用Student's t检验.

2 结果

2.1 血浆和肝组织中各检测指标含量的变化

2.1.1 血浆和肝组织中ET-1含量的变化: 肝脏缺血再灌注后, 血浆和肝组织中ET-1含量均显著升高, 于再灌注后第3小时达到高峰, 此后缓慢下降, 与A组比较, 其他各组均有明显的统计学意义(P<0.01, P<0.05); 应用山莨菪碱后, ET-1略有下降, 但与B, C组无明显统计学意义, 见表1, 表2.

表1 血浆ET-1含量的变化(mean±SD, pg/mL).

再灌注时间	1 h	3 h	6 h	12 h	24 h
B组	5.2±1.3^a	12.8±1.2^a	5.6±1.6^a	4.8±0.8^a	4.1±0.8^a
C组	4.8±0.3^a	11.5±0.6^a	7.3±0.4^a	4.5±1.8^a	4.2±0.6^a
D组	4.2±1.6^a	9.3±0.8^a	5.2±1.2^a	4.0±0.8^a	3.9±0.4^a

^aP<0.01 vs A组(1.1±0.5).

表2 肝组织中ET-1含量的变化(mean±SD, ng/100 mg).

再灌注时间	1 h	3 h	6 h	12 h	24 h
B组	314±34^b	650±82^a	381±68^a	325±65^b	206±25
C组	302±25^b	570±48^a	385±56^a	302±60^b	210±30
D组	284±20^b	582±60^a	360±48^a	310±58^b	198±31

^aP<0.01 vs A组(164±30),

^bP<0.05 vs A组.

2.1.2 血浆ALT含量的变化: 血浆ALT于缺血再灌注后第6小时达高峰, 再灌注后24 h仍维持在较高水平, 与A组比较, 其他各组均有统计学意义(P<0.01); 应用山莨菪碱后, 血浆ALT含量明显下降, 与B、C组比较有统计学意义(P<0.05), 见表3.

表3 血浆ALT含量的变化(mean±SD, u/L).

再灌注时间	1 h	3 h	6 h	12 h	24 h
B组	137±32^a	144±33^a	182±36^a	162±28^a	148±32^a
C组	140±35^a	148±38^a	176±28^a	152±42^a	150±36^a
D组	82±12^a^b	88±15^a^b	102±14^a^b	91±25^a^b	90±18^a^b

^aP<0.01 vs A组(19±4),

^bP<0.05 vs B, C组.

2.1.3 肝组织中MDA含量的变化: 肝脏缺血再灌注后, 肝组织中MDA含量增加, 第6小时达高峰, 第24 小时基本接近正常水平, 与A组比较, B、C组有统计学意义(P<0.01, P<0.05), D组与B、C组相比, 部分时相点有统计学意义(P<0.05), 见表4.

表4 肝组织中MDA含量的变化(mean±SD, nmol/g).

再灌注时间	1 h	3 h	6 h	12 h	24 h
B组	7.9±1.2^b	8.2±1.0^b	11.2±1.6^a	10.2±1.4^a	6.5±0.6
C组	7.4±0.8^b	9.4±0.6^a	10.4±1.8^a	9.6±2.0^a	6.0±0.4
D组	6.0±0.4	6.2±0.8	6.0±1.2^c	5.2±0.3^c	4.4±0.6

^aP<0.01 vs A组(4.0±1.1);

^bP<0.05 vs A组;

^cP<0.05 vs B, C组.

2.1.4 肝细胞内[ Ca²⁺]i含量的变化: 肝脏缺血再灌注后, 肝细胞内[Ca²⁺]i含量升高, 与A组(154±12 nmol/L)比较, B组(384±16 nmol/L)、C组(368±15 nmol/L)均有统计学意义(P<0.01); 而D组(218±14nmol/L)与B、C组比较也有统计学意义(P<0.05).

2.2 肝组织病理学变化

光镜下正常对照组肝细胞和肝窦内皮细胞均正常. 缺血再灌注组和生理盐水组肝脏瘀血明显, 以门静脉为中心向周边呈放射状排列, 同时, 肝细胞可见不同程度的浊肿变性和空泡状变性, 偶尔可见点状坏死; 晚期主要以肝细胞局灶性及片状坏死为主. 山莨菪碱组再灌注后早期肝脏的瘀血明显减轻, 细胞变性坏死不明显, 晚期偶尔可观察到点状坏死, 无成片状细胞坏死.

3 讨论

我们在实验中观察到, 肝脏缺血再灌注后血浆ET-1、ALT和肝组织中ET-1、MDA、肝细胞内[Ca²⁺]i含量均显著增加, 说明肝脏缺血再灌注后导致了肝细胞损伤. 研究发现[7,8], 在肝血管平滑肌细胞和肝窦贮脂细胞膜上存在ETＡ和ETＢ受体, ET-1可作用于ETＡ受体, 使平滑肌细胞和贮脂细胞收缩, 最终导致肝脏微循环障碍, 使入肝血流量减少[9]. 肝脏缺血缺氧时, ATP生成减少甚至停止, 同时ATP 分解加速, ATP的减少可降低Na+-K+-ATP酶和Ca²⁺-ATP酶的活性, Na+ 和Ca²⁺便在细胞内蓄积, 导致细胞水肿和细胞内Ca²⁺超载. 细胞内Ca²⁺超载可激活Ca²⁺依赖性蛋白水解酶, 在ATP降解产物代谢过程中, 可促进活性氧自由基的生成[9]. ET-1还可刺激兴奋性氨基酸的释放, 促进中性粒细胞的黏附, 活化释放蛋白酶产生氧自由基[10,11]. 氧自由基可导致脂质过氧化反应, 使细胞膜和膜酶损伤, 同时, 非自由基的醛式代谢产物还能带着自由基的损伤潜能, 从其生成的部位如内质网扩散到线粒体、核糖体和其他细胞成分, 导致细胞和细胞组分的损伤.

肝脏缺血再灌注前应用山莨菪碱, 可使肝细胞内[Ca²⁺]i和肝组织中MDA的含量明显下降, 以及肝酶的漏出减少, 说明山莨菪碱可以减轻肝细胞内Ca²⁺超载并降低氧自由基的产生. 山莨菪碱可嵌入细胞膜脂质双层, 增加膜的流动性, 有利于细胞膜发挥其功能[12-14]. 山莨菪碱还具有稳定细胞内溶酶体膜, 保护线粒体和提高细胞利用氧的能力, 同时还可以增强线粒体固定Mg²⁺ 的能力, 从而减少Mg²⁺ 的丢失[15]. 由于应用山莨菪碱后细胞膜和细胞器膜受到了较好的保护, 同时Mg²⁺ 的丢失减少, 故可以减轻肝细胞和线粒体内Ca²⁺ 超载. 研究发现, 山莨菪碱还可通过蛋白激酶C系统阻断Ca²⁺内流, 从而减轻肝窦内皮细胞和肝细胞的损伤. 细胞内Ca²⁺超载的减轻, 可以减少Ca²⁺依赖性蛋白水解酶的激活, 减少黄嘌呤脱氢酶向黄嘌呤氧化酶的转化, 从而可使氧自由基的生成减少. 由此可见, 山莨菪碱可以减少氧自由基的生成, 对肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用.

备注

编辑: N/A

参考文献

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