100023 北京市2345信箱 世界华人消化杂志  2001年9月15日;9(9):997-7002
Email: wcjd@public.bta.net.cn 世界华人消化杂志  ISSN 1009-3079  CN  14-1260/R
http:// www.wjgnet.com 版权归世界胃肠病学杂志社

⊙研究原著⊙

舒林酸抑制人胃腺癌细胞增殖及诱导凋亡

孙波1 吴云林1 张学军2 王升年2 贺恒益2 乔敏敏1 章永平1 钟捷1

1上海第二医科大学附属瑞金医院消化科  上海市 200025
2中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所 上海市 200031
孙波，男，1972-01-19生，上海市人，汉族. 2001年上海第二医科大学硕士毕业.本课题为日本Asahi医学基金会资助项目.
项目负责人  孙波, 200025, 上海市瑞金二路197号, 上海第二医科 大学附属瑞金医院消化内科. Sunbo2001@yahoo.com.cn
Tel: 021-64370045 Ext. 665241
收稿日期  2001-05-30  接受日期  2001-07-28


Effects of Sulindac on growth inhibition and apoptosis induction in human gastric cancer cells

Bo Sun1, Yun-Lin Wu1, Xue-Jun Zhang2, Sheng-Nian Wang2, Heng-Yi He2, Min-Min Qiao1, Yong-Ping Zhang1  and Jie Zhong1
1Department of Gastroenterology, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University,  Shanghai 200025, China
2Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200025, China
Correspondence to  Bo Sun, Department of Gastroenterology, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University,  Shanghai 200025, China. Sunbo2001@yahoo.com.cn
Received  2001-05-30  Accepted  2001-07-28


Abstract
AIM  To characterize the effects and its mechanisms of Sulindac in inducing growth inhibition and apoptosis in human gastric cancer cell lines.

METHODS  The human gastric cancer cell lines MKN45 and MKN28 were included in the study. Antiproliferative effects were measured by MTT assay, and apoptosis was determined by Hoechst33258 staining, electronograpy and DNA fragmentation. The protein of cyclooxygenase-2 (COX-2) and Bcl-2 were detected by Western dot blotting.

RESULTS Sulindac could inhibit the growth of gastric cells in a dose- and time-dependent manner. The effects of growth inhibition were different between gastric cancer cell lines. The apoptosis of gastric cell lines could be induced by Sulindac in a dose- and time-dependent manner. The apoptosis rates were also different. After 24h of incubation with Sulindac at 2mmol·L-1 and 4mmol·L-1, the expression of COX-2 and Bcl-2 were reduced in MKN45 cells but not in MKN28 cells.

CONCLUSION  Sulindac could inhibit effectively the growth of two gastric cell lines in vitro by apoptosis induction, which was associated  with regression of COX-2 and Bcl-2. The different effects of apoptosis in gastric cancer cells may be related to the differentiation of the cells.

Subject headings stomach neoplasms/pathology; adenocarcinoma/pathology; Sulindac/pharmacology; tumor cells, cultured/drug effects; cell division/drug effects; apoptosis/drug effects

Sun B, Wu YL, Zhang XJ, Wang SN, He HY, Qiao MM, Zhang YP, Zhong J. Effects of Sulindac on growth inhibition and apoptosis induction in human gastric cancer cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 2001;9(9):997-1002


摘要
目的  在体外对舒林酸抗人胃腺癌细胞增殖和凋亡诱导作用及其机制 进行初步研究.

方法 采用人胃腺癌细胞株MKN45, MKN28作为研究对象. 体外药物敏感 试验（MTT）检测不同浓度和作用时间的舒林酸对细胞的增殖抑制效应；分别用Hoechst3325 8细胞核荧光染色、透射电镜和DNA琼脂糖凝胶电泳观察舒林酸诱导的细胞凋亡改变；应用Western斑点免疫印迹法观察经舒林酸2mmol·L-1和4mmol·L-1 作用24h后细胞内环氧化酶-2（COX-2）和凋亡抑制蛋白Bcl-2表达程度的变化.

结果 舒林酸对人胃腺癌细胞MKN45, MKN28的杀伤率随着剂量的增大和 作用时间的延长而增加，舒林酸对不同类型的细胞杀伤率不同. 舒林酸能够诱导人胃腺癌 细胞MKN45, MKN28产生凋亡，凋亡诱导作用的强弱同样具有时间和剂量依赖性，而且对不同 类型胃癌细胞的凋亡诱导效应有显著差异. 经舒林酸2mmol·L-1和4mmol ·L-1作用24h后，MKN45细胞内COX-2和Bcl-2蛋白比未经舒林酸作用的细 胞表达明显减少, 而MKN28细胞内COX-2和Bcl-2蛋白的表达未出现明显变化.

结论 舒林酸在体外对人胃腺癌细胞株MKN45和MKN28有良好的增殖抑制作 用，诱导凋亡是其抑制胃癌细胞增殖的重要作用机制. 舒林酸对人胃腺癌细胞的抑制和凋亡诱导作用与其抑制细胞内环氧化酶-2，并进而抑制Bcl-2的表达有关，并可能与胃癌细胞的分化状态有关.

主题词  胃肿瘤/病理学；腺癌/病理学；舒林酸/药理学；肿瘤细胞，培养的/药物作用；细胞分裂/药物作用；脱噬作用/药物作用

孙波, 吴云林, 张学军, 王升年, 贺恒益, 乔敏敏, 章永平, 钟捷. 舒林酸抑制人胃腺癌细胞增殖及诱导凋亡.
世界华人消化杂志, 2001;9(9):997-1002


0  引言
非甾体类消炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAID）如阿司匹林、吲哚美辛（indomethacin）等在临床上被广泛用于抗炎、解热、镇痛和抗血小板聚集. 近年研究表明, NSAID具有抑制结直肠肿瘤增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的作用［1]. 舒林酸（sulindac）作为NSAID的家族成员之一， 被应用于家族性腺瘤性息肉病（familial  adenomatous polyposis, FAP）患者的治疗，能显著减少息肉的数量，预防结直肠腺瘤的 复发［2,3］，降低结肠腺癌的发生率［4], 从而显示出了独特的疗效. Rahman et al[5］首次在对肝细胞癌体外研究中发现，舒林酸对肝癌细胞具有 增殖抑制作用，并且能诱导肝癌细胞产生凋亡，从而提示舒林酸不仅仅适用于结直肠肿瘤的化学预防，对结直肠以外的消化系肿瘤可能同样具有良好的化学预防作用. 在我国，胃癌 是常见的消化道恶性肿瘤［6-9], 进展期胃癌的治疗效果不尽如人意［10,11] ，预防和早期发现胃癌是降低胃癌发病率及死亡率极其重要的手段. 许多化学药物已被证 明能诱导胃癌细胞发生凋亡，为胃癌的治疗提供了新的途径［12,13]. 近年研究证 明, 环氧化酶-2 (Cyclooxygenase-2, COX-2)的过度表达是胃癌发生中的早期事件［ 14］，为胃癌的化学预防提供了重要的线索和靶目标. 我们在体外对舒林酸抗人胃腺癌 增殖的作用进行了相关的基础研究，并就其作用机制以及用于胃癌早期预防和治疗的可行性进行初步的探讨.

1  材料和方法
1.1 材料 选用低分化的人胃腺癌细胞株MKN45和高分化的人胃腺癌细胞株MKN28为研究对象, 在含100L·L-1的RPMI 1640细胞培养液(美国Gibco BRL公司产品)中37℃, 50mL·L-1 CO2条件下传代培养；舒林酸（sulindac），购自美国Sigma公司；硝酸纤维素膜，美国Amersham公司产品；光敏反应试剂（Luminal Reagent），美国Santa Cruz公司产品；X线胶片，上海感光材料公司产品；四氮唑蓝（MTT），美国Biotrin 公司产品；二甲基亚砜（DMSO），美国Sigma公司产品；Hoechst-33258，美国CNI公司产品 ；兔抗人COX-2多克隆抗体（H-62, sc-7951），美国Santa Cruz公司产品；小鼠抗人bcl-2 mAb（Cat.No.M-0025），美国抗体诊断公司产品；山羊抗小鼠HRP标记IgG（Cat#sc -2005），美国Santa Cruz公司产品；山羊抗兔 HRP标记IgG（Cat#sc-2004），美国Dako 公司产品.
1.2 方法
1.2.1 体外药物敏感试验 按噻唑蓝（MTT）法，取对数生长期的细胞 以每孔1×104个细胞接种于96孔细胞培养板中，37℃，5% CO2条件下培养24h， 分别加入以DMSO溶解的不同浓度的舒林酸 ：0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4mmol·L-1 （培养液内的DMSO不超过5g·L-1)，每个浓度各设3个复孔，并设含相同浓度DMSO的空白对照，继续培养24h和48h，每孔加1g·L-1的MTT 0.1mL；作用4h后，加DMSO溶液0.1mL，孵育30min；用318型酶联免疫测定仪测定570nm处的A值，并计算杀伤率. 整个实验重复3次以上. 杀伤率(%)=(对照孔A均值-试验孔A均值)×100%/对照孔A均值.
1.2.2 Hoechst-33258细胞核荧光染色及凋亡指数测定 细胞用不同浓度的舒林酸分别孵育24h和48h，按时收集细胞；用20g·L-1多聚甲醛固定10min后用10g·L-1 Hochest-33258在37℃下避光作用1h；PBS洗涤后取细胞悬液15μL滴于载玻片上，荧光显微镜观察（紫外光激发）并摄影. 计数300个以上细胞，以出现细胞体积缩小、细胞核固缩、染色质边集和凋亡 小体形成判断为凋亡细胞并计算凋亡指数（AI）. AI=凋亡细胞数/(正常细胞+凋亡细胞) ×100%.
1.2.3 透射电镜检测 细胞经舒林酸2mmol·L-1 作用24h后收集于离心管内，用4℃ 25g·L-1戊二醛作预固定24h，样品经磷酸缓冲液（pH 7.2）冲洗后，用20g·L-1锇酸作后固定，再用磷酸缓冲液冲洗，然后用梯度乙醇脱水，环氧树脂EPON812包埋，作超薄切片，用醋酸钠和柠檬酸铅双染色，透射电镜下观察细胞形态.
1.2.4 细胞DNA抽提及琼脂糖凝胶电泳 细胞经不同浓 度的药物孵育，按时收集细胞. 冷冻的700mL·L-1乙醇固定24h后去除固定液，细胞用0.2mol·L-1 Na2HPO4/0.1mol·L-1 柠檬酸（192∶8）40μL pH 7.8重悬，室温下放置30～60min, 1000×g 离心5min, 吸取上清于新的Eppendorf管中，真空抽干15min, 加2.5g·L-1 NP-40 4μL和10g·L-1 RNase A溶液4μL 37℃孵育30min, 加1g·L-1 Protein K 4μL，50℃孵育30min. 取样品15μL加loading buffer 3μL，于10g·L-1含5mL·L-1 EB的琼脂糖凝胶上2V·cm-1电泳.
1.2.5 Western斑点印迹法 细胞分别经舒林酸0, 2和4mmol·L-1作用24h，细胞裂解液抽提细胞内总蛋白，在紫外分光光度仪上测定样品总蛋白含量. 每组各取总蛋白样品100μg点样于硝酸纤维素膜上，加封闭液在室温下作用2h后弃去，加入一抗置于4℃条件下作用过夜后分别加入HRP-二抗（羊抗兔）和HRP-二抗（羊抗小鼠）于室温下作用2h，按ECL法将光 敏试剂A液、B液各0.5mL混匀后滴加于硝酸纤维素膜上作用2min后弃去，将硝酸纤维 素膜固定于X线胶片暗盒内，暗室下压片、显影、定影. 统计学处理 应用美国SAS公司医学统计软件Statistical Analysis Sydtem (SAS) 进行Student T检验和方差检验.

2  结果
2.1 人胃腺癌细胞生长 体外药物敏感试验（MTT）结果显示舒林酸对胃癌细胞的杀伤率均随着剂量的增大和作用时间的延长而增加，对高分化的MKN28细胞的杀伤率小于低分化的MKN45细胞，4mmol·L-1舒林酸作用24h后对MKN45细胞的杀伤率达68.5%，而对MKN28细胞的杀 伤率则为46.4%；0.5mmol·L-1作用24h后对MKN45细胞的杀伤率即与 对照组统计学上有显著差异（P＜0.01），而MKN28细胞则在1mmol·L-1 浓度时才与对照组有显著差异，48h后则各用药组均与对照组有显著差异（图1, 表1）.

图1  舒林酸对人胃腺癌细胞的杀伤率(n=3).

2.2细胞凋亡与形态 Hoechst-33258染色结果表明， 舒林酸能够诱导人胃腺癌细胞MKN45, MKN28凋亡，凋亡诱导作用的强弱随着舒林酸作用时间的延长和浓度的增加而增强，对不同分化程度的胃癌细胞的凋亡诱导作用有显著差异，4mmol·L-1浓度作用24h后，低分化的MKN45细胞的凋亡率为49.1%，而高分化的MKN28细胞则为8.0%，相同浓度下二种胃癌细胞的凋亡指数统计学上均有显著差异（P＜0.01,图2).  细胞经Hoechst33258荧光染色后，荧光显微镜下观察发现正常细胞核形态饱满，表现为弥散均匀的蓝色荧光，凋亡细胞则出现细胞核体积缩小，荧光染色增强，染色质呈致密浓染的块状或颗粒状荧光以及凋亡小体形成（图3）. 而且凋亡细胞数量随着药物作用时间的射电镜下观察发现正常细胞的细胞核和细胞器亚微结构清晰，核膜完整，而不同浓度的舒林酸作用后的细胞呈现典型的凋亡形态学变化，出现细胞核固缩、染色质凝集、染色质聚集于核膜周边或形成境界分明的新月形小体以及胞质空泡形成等（图4）.

图2 舒林酸作用人胃腺癌细胞后凋亡指数(n=3).

表1  舒林酸对人胃腺癌细胞的杀伤 （n=3, x±s, A）

Time Cell line    c (mmol·L-1)
0 0.25 0.5 1 2 4
24h MKN28 0.56±0.08 0.55±0.06 0.52±0.08 0.45±0.07a 0.40±0.06 0.30±0.03
MKN45 0.92±0.11 0.86±0.08 0.78±0.06a 0.62±0.04 0.43±0.04 0.29±0.03
48h MKN28 0.66±0.07 0.59±0.07b 0.54±0.05a 0.46±0.05 0.35±0.04 0.25±0.04
MKN45 0.43±0.06 0.38±0.05b 0.30±0.03a    0.23±0.03 0.15±0.02 0.14±0.02

aP＜0.01, bP＜0.05, vs 对照组.

图3A: 未用药物处理, 细胞核形态饱满，呈弥散均匀的蓝色荧光; B: 舒林酸作用MKN45, 细胞体积缩小，荧光染色增强，染色质呈致密浓染的块状或颗粒状伴凋亡小体形成.

图4 舒林酸2mmol·L-1作用后凋亡的MKN45细胞半部.
A: 12h, 细胞核染色质固缩，胞质内空泡形成 BM×5760
B: 24h, 细胞核染色质凝集，呈典型的新月型边际于核膜 BM×7680

2.3 细胞DNA电泳和COX-2和Bcl-2蛋白表达 凝胶电泳 结果显示舒林酸作用后的胃癌细胞出现典型的“DNA梯带”. Western斑点印迹反应结果显 示2株细胞中均有COX-2和Bcl-2蛋白的表达，人胃腺癌细胞MKN45经舒林酸2和4mmol· L-1作用24h后，细胞内COX-2和Bcl-2比未经舒林酸作用的细胞表达明显减少，而在MKN28细胞内COX-2和Bcl-2蛋白的表达则未出现明显变化（图5）.

图5  舒林酸作用后人胃腺癌细胞内COX-2及Bcl-2蛋白的表达.


3  讨论
Adolphie et al发现某些NSAID能够在体外抑制Hela细胞增殖后，NSAID抗肿瘤细胞增 殖的作用逐渐引起人们的重视，尤其在近十几年中，对这类药物在肿瘤的预防、治疗及其作 用机制方面进行了大量的基础和临床研究［15,16]. 研究结果表明催化花生四烯酸 转化为前列腺素的关键酶—环氧化酶是NSAID抗肿瘤的关键作用部位. 在人体内共存在2种 类型的环氧化酶，即COX-1和COX-2，前者为结构型酶，存在于体内大多数正常组织中， 具有保护胃粘膜细胞、肾血管扩张以及控制血小板聚集等重要作用；COX-2为诱导型酶[17］，通常在大多数正常组织中不表达［18］，许多类型的炎症细胞因子、生 长因子和各种促癌因素等均可诱导体内组 织产生COX-2［19]. COX-2表达增高往往提示炎症或肿瘤的存在［20-25] ，COX-2在胃肠道肿瘤中的表达尤其显著. 104例行根治性胃癌手术患者的所有胃癌组织中 均有COX-2表达，而正常胃粘膜组织中未见COX-2蛋白的表达［13]. Ratnasinghe et al[26］调查了34例中国胃癌患者，发现COX-2在36%的胃贲门 癌和60%的胃体癌中表达呈阳性，同一患者的正常胃粘膜组织中未见其表达, 研究也证明胃 癌组织较邻近的正常胃粘膜上皮能产生更多的前列腺素. COX-2还与实体肿瘤的血管生成[27,28］以及转移性［29,30］有关，因此COX-2与胃癌的发生发展密 切相关［22]. 我们通过采用Western蛋白印迹的方法显示2株人胃腺癌细胞MKN45,  MKN28中均有COX-2蛋白的表达，MKN28细胞内的COX-2的表达低于MKN45，与其他研究结果 相同，进一步证明COX-2与消化系肿瘤的发生和发展相关. 初步的临床研究表明NSAID对结 直肠肿瘤具有一定的化学预防和治疗作用，最具有说服力的证据之一是长期服用阿司匹林使结直肠肿瘤的发病率减少40%～50%，另一个证据即舒林酸在家族性腺瘤性息肉病患者中的 良好疗效［31], 研究表明舒林酸主要通过诱导细胞凋亡而起作用［32]. 然而，目前舒林酸的抗肿瘤增殖和凋亡诱导效应尚未在对胃癌的研究中得到充分证明. 我们采用的2株人胃腺癌细胞具有不同的分化状态，其中MKN45为低分化的胃腺癌细胞，而MKN28则为高分化的胃腺癌细胞. 舒林酸对这2种分化状态不同的胃癌细胞均有增殖抑制作用，并且都能诱导细胞产生凋亡. 体外药物敏感试验证明其对胃癌细胞的杀伤率随着剂量的增 大和作用时间的延长而增加，细胞凋亡指数同样具有时间和剂量依赖性. 所不同的是舒林酸对不同分化程度的人胃腺癌细胞的杀伤率不同，对高分化的MKN28细胞的杀伤率小于低分化的MKN45细胞；与之相应的是它对2株胃癌细胞的凋亡诱导效应也不同，高分化的MKN28细胞的凋亡指数小于低分化的MKN45细胞. 由于这2种胃癌细胞内COX-2的表达强弱不同，MKN28细胞内COX-2的表达低于MKN45细胞，因此舒林酸对2株胃癌细胞凋亡 作用的强弱差异除了可能与细胞不同的分化状态有关外，还可能与细胞内COX-2的表达强弱有关. 本研究结果提示如同在结直肠肿瘤中的作用一样，舒林酸诱导胃癌细胞凋亡是其抗人胃腺癌作用的重要机制之一. 由于舒林酸口服后在体内主要通过肠道菌丛和肝脏代谢产生二种衍生物sulfide和sulfone，使其活性大大增强［33］，提示舒林酸体外 抗肿瘤的效应在体内会可能得到进一步的增强，尤其是对胃癌的作用强弱需要在动物或人体 内进一步加以研究比较.在细胞凋亡调控机制方面，bcl-2是迄今研究最为深入和广泛的凋亡调控基因之一 ［34］. 以往研究显示, bcl-2能够影响多种凋亡相关变化，包括抑制caspase-3的 活性、抑制凋亡早期的细胞膜内的磷脂酰丝氨酸外翻以及改变细胞氧化还原状态等. 动物试验发现COX-2表达的增加促使大鼠肠道表皮细胞Bcl-2蛋白表达增加，使细胞凋亡减 弱［35].  COX-2的催化产物之一前列腺素E2能够抑制人结肠癌细胞株的凋亡并且 增加细胞内Bcl-2的表达［36]. Liu et al［37］的研究也发现COX-2选择性抑制剂NS-398能诱导前列腺癌细胞凋亡并下调其Bcl-2的表达水平，众多类似的研 究证明Bcl-2在细胞凋亡调控途径中处于COX-2的下游位置. 我们通过蛋白免疫印迹方法观察到经舒林酸作用后，胃癌细胞MKN45内COX-2的表达较未经药物 作用的对照组显著减少，其Bcl-2的表达同样较对照组细胞减少，而在COX-2未出现明显变 化的MKN28细胞中，Bcl-2的表达状况相应的也未有改变，细胞的凋亡程度和数量也小于MKN 45细胞，因此在舒林酸诱导胃癌凋亡的作用中，至少COX-2是其重要的作用靶点之一. 这进一步说明Bcl-2参与了舒林酸诱导胃癌细胞凋亡的途径，并且提示舒林酸通过抑制COX-2进而抑制Bcl-2的表达而诱导胃癌细胞产生凋亡.目前的研究认为在NSAID抗肿瘤的作用机制中除了COX-2途径外，还有COX-2非依赖性途径［38-42］包括对细胞周期的影响, 影响NF-κB的活性和P53的表达, RAS信号传递途径的调节等. 最近，Shureiqi et al[43］研究发现， sulindac sulfone 和NS-398通过上调15-脂氧化酶-1而诱导大肠癌细胞株出现凋亡，并且其作用不依赖于COX-2. 舒林酸与其衍生物在诱导肿瘤细胞出现凋亡时也有着不同的作用机制［44] ，如前所述，在舒林酸的二种衍生物中sulifide是COX的强力抑制剂，是舒林酸抗炎作用的 主要方面，sulfone对COX的活性则即无抑制作用也无抗炎作用，而研究却发现sulfone可以 起到与舒林酸相似的对肿瘤的化学预防作用；舒林酸和它的衍生物exisulind对肝癌细胞株 均有显著的增殖抑制效应，但与舒林酸相反，exisulind无论对COX-1还是COX-2均无抑制 作用［5］，故目前对舒林酸抗肿瘤的作用机制尚未取得一致的研究结论. 本研究中相同作用浓度下舒林酸对MKN28细胞的杀伤率大于其凋亡指数，也提示舒林酸可能 具有凋亡诱导以外的抑制胃癌细胞增殖的作用机制. 对舒林酸及其衍生物抗肿瘤的COX-2非依赖性途径的研究可能会提供尚未发现的肿瘤凋亡诱导机制，是今后研究的方向之一.随着COX-2选择性抑制剂如celecoxib和rofecoxib的问世，使非甾体类消炎药不良反应的发 生率显著降低［45］，适合于临床上的长期治疗，但对于这些药物的抗肿瘤作用的 研究处于起步阶段［46,47］，尚未明了其抗肿瘤效应是否优于常用的吲哚美辛和阿 司匹林等COX-2非选择性抑制剂，对COX-2非选择性抑制剂抗肿瘤作用的研究仍有助于阐明其作用机制，作为COX-2非选择性药物之一，舒林酸几乎不影响肾脏前列腺素的合成[48］，因此相对于阿司匹林和消炎痛而言，更适合用于临床研究. 目前尚不知道该药物体内达到抑制肿瘤生长和诱导肿瘤细胞产生凋亡所需要的剂量和作用时间，是今后进一步研究的方向.

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