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100023 北京市2345信箱	世界华人消化杂志 2001年6月15日;9(6):645-648
Email: wcjd@public.bta.net.cn	世界华人消化杂志 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R
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⊙研究原著⊙

脂质过氧化在二甲基亚硝胺大鼠肝纤维化形成过程中的作用

陈文慧刘平徐光福陆雄熊卫国李风华刘成海

上海中医药大学肝病研究所上海市 200032
陈文慧，女，1963-10-27生，云南省昆明市人，汉族. 1986年云南中医学院毕业，副教授，
主要从事中西医结合治疗肝病的研究工作，发表论文10篇.
上海市教育发展基金会上海市教委曙光计划资助项目,No.99SG44
项目负责人刘成海上海中医药大学肝病研究所上海市 200032
Institute of Liver Diseases, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China
Supported by Shanghai Eucation Shuguang Program, No.99SG44
Correspondence to:Dr. Cheng-Hai Liu, Institute of Liver Diseases, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,
Shanghai 200032, China
Tel. 0086-21-54231109, Fax. 0086-21-64036889
Email. chenghailiu@hotmail.com
Received 2001-01-08 Accepted 2001-01-11

Role of lipid peroxidation in liver fibrogenesis induced by dimethylnitrosamine in rats

Wen-Hui Chen, Ping Liu, Guang-Fu Xu, Xiong Lu, Wei-Guo Xiong, Feng-Hua Li and Cheng-Hai Liu

Abstract

AIM To investigate the role of lipid peroxidation in the liver fibrogenesis induced by dimethylnitrosamine in rats.

METHODS The liver fibrotic model was induced by i.p. dimethylnitrosamine (DMN) for 4wk. While making model for 4wk and an other 4wk after stopping intoxication, the following indexes were observed consecutively each week: serum liver function including ALT, AST, albumin and total bilirubin, Hyp content of liver tissue, SOD, GSH and GSH-PX activities, MDA contents etc. Hepatic tissue inflammation and necrosis, collagen deposition in liver were observed at the same time.

RESULTS The liver function was obviously abnormal in the model, ALT increased from the second week and got its highest one at the fourth week. The total bilirubin changed at the second week, while albumin content decreased at the first week and went down to the lowest at the fifth week. At the fourth week, there were inflammatory cell infiltration in the portal areas and widely bleeding and necrosis, and the wide fibrous septa were formed, which remained obvious at the eighth week. The hepatic Hyp level slightly increased at the second week, reached the peak at the fourth week and sustained high level later. At week 1-2, SOD and GSH-PX levels decreased significantly, GSH decreased but MDA content increased in hepatic tissue, and these changes reached their peaks at week 2-3. Hepatic Hyp content was negatively related to SOD activity，but positively to MDA content.

CONCLUSION Lipid peroxidation occurred before collagen deposition in liver during DMN induced fibrogenesis, they were significantly correlated. The lipid peroxidation injury was one of the main mechanisms of liver fibrogenesis induced by DMN in rats.

Subject headings liver fibrosis; lipid peroxidation; collagen; dimethylnitrosamine

Chen WH, Liu P, Xu GF, Lu X, Xiong WG, Li FH, Liu CH. Role of lipid peroxidation in liver fibrogenesis induced by dimethylnitrosamine in rats. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 2001;9(6):645-648

摘要

目的探讨脂质过氧化损伤在二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化形成中的作用.

方法二甲基亚硝胺腹腔注射4wk诱导大鼠肝纤维化模型. 连续每周动态观察染毒4wk及染毒停止后4wk大鼠血清肝功能（ALT, AST, 清蛋白、总胆红素）、肝组织羟脯氨酸（Hyp）含量、SOD、GSH与GSH-PX活性、MDA含量等变化. 连续同步观察大鼠肝组织炎症坏死与胶原沉积等的变化.

结果模型大鼠血清肝功能明显异常，ALT自2wk开始升高，4wk达高峰，以后维持较高水平；总胆红素自2wk出现异常；清蛋白含量自1wk开始下降，5wk时为最低. 4wk时肝组织HE染色见汇管区肝细胞浸润及较广泛出血坏死，胶原染色显示有宽大纤维间隔形成，至8wk时仍较明显. 肝组织Hyp含量2wk时轻微增加，4wk时达高峰，而后持续较高水平. 2wk～3wk时，大鼠肝组织SOD与GSH-PX活性下降、GSH含量下降、MDA含量上升，并达到高峰. 相关分析发现，肝脏Hyp含量与SOD活性明显负相关，而与MDA含量之间呈显著的正相关.

结论脂质过氧化显著损伤出现在肝脏胶原沉积之前，两者之间明显相关，脂质过氧化损伤是二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化形成的重要机制.

主题词 肝纤维化；脂质过氧化；胶原；二甲基亚硝胺

陈文慧, 刘平, 徐光福, 陆雄, 熊卫国, 李风华, 刘成海. 脂质过氧化在二甲基亚硝胺大鼠肝纤维化形成过程中的作用.
世界华人消化杂志，2001；9(6)：645-648

0 引言

肝纤维化以肝脏细胞外基质大量增生并沉积于肝脏为特征^［^1-5^］，其中心病理环节为肝星状细胞活化^［^5-13^］. 大量研究表明，在CCl₄、酒精、铁过载等所引起的肝纤维化，往往与脂质过氧化密切相关^［^14-42^］. 体外研究发现，脂质过氧化产物丙二醛（malondiadehyde, MDA）可直接刺激星状细胞活化及胶原基因表达^［⁴³^］. 二甲基亚硝胺（dimethylnitrosamine, DMN）诱发的大鼠肝纤维化，具有病变持续、病理稳定、不易自愈等特点，但对其发病机制尚不完全清楚^［^44-47^］. 既往多认为与该物质的基因毒有关，是否存在脂质过氧化损伤等尚未肯定. 我们通过动态观察DMN大鼠肝纤维化中染毒过程中与染毒后肝脏脂质过氧化相关指标的变化，探讨脂质过氧化损伤在DMN肝纤维化形成中的作用.

1 材料和方法

1.1 材料 Wistar大鼠80只，雄性，SPF级，体重150g～160g，购自中科院上海实验动物中心（合格证号：中科动管第1999-004号），上海中医药大学实验动物中心清洁级动物房饲养、造模与观察，自由饮水，普通饲料喂养. DMN，为瑞典威灵公司产品，分子式C₂H6N₂O，M_r74.08，羟脯氨酸标准品（Hydroxyproline, Hyp）为日本ナカラィテスケ株式会产品. MDA、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）试剂盒，购自南京建成生物工程公司. 肝功能（AST、ALT、总胆红素、清蛋白）测定试剂盒，购自上海生物制品研究所，其余试剂均为国产分析纯.

1.2 方法 动物模型制备：参照Alakkok方法^［⁴^］. 9g·L^-1 NaCl稀释DMN为0.5mL·L^-1浓度，以0.5g·L^-1 DMN 2mL·kg^-1大鼠体重（10μg DMN/kg）的剂量腹腔注射，1次·d^-1，每周连续3d，共4wk. 观察时相：80只大鼠随机分正常组24只，模型组56只. 设连续观察时间为造模2d, 第1, 2, 3, 4, 5, 6, 8wk末. 每个时相点均设正常大鼠3只，模型大鼠6只. 其中d2～4wk为染毒期，5wk～8wk为染毒后期. 血清总蛋白（T.Pro），双缩脲法；清蛋白（Alb），溴钾酚绿比色法；门冬氨酸氨基转移酶（AST），比色法；丙氨酸氨基转移酶（ALT），赖氏法；总胆红素（T.Bil），重氮法，均按试剂盒说明进行. 肝组织羟脯氨酸含量测定：采用Jamall et al^［⁵^］方法. 每份标本称取湿肝100mg，加入双蒸水2.5mL，匀浆(2000r·min^-1, 50s, 4℃). 加入等体积的12mol·L^-1 HCl，105℃水解18h，过滤，取水解液100μL烘干. 经与氯铵T溶液、欧氏溶液(为250g·L^-1对二甲基氨基甲苯、273mL·L^-1高氯酸的异丙醇溶液)50℃, 30min水浴反应，紫外分光光度仪558nm处测定反应液A(OD)值，计算标准曲线回归方程及样品Hyp含量. 肝组织Hyp含量以“Hyp μg·g^-1肝组织”表示. 肝组织经冷生理盐水漂洗，除去血液，滤纸吸干，称取100mg匀浆（6000r·min^-1，30s, 4℃），离心（4000r·min^-1，15min, 4℃），取上清液，制备100g·L^-1肝组织匀浆液待用. 按试剂盒说明进行各指标测定. 肝组织总蛋白（双缩脲法）按试剂盒说明测定. SOD活性单位换算为“亚硝酸盐(NU) ·g^-1肝组织”. MDA单位为“μmol·g^-1肝组织”. GSH含量单位为“g·g^-1蛋白”，GSH-PX活性单位为“U·g^-1蛋白”. 病理学观察肝组织于100mL·L^-1中性福尔马林缓冲液固定，石蜡包埋，切片5μm厚度，多级酒精脱水，二甲苯透明，分别作HE及胶原纤维染色观察肝组织病理变化.

统计学处理双侧t检验.

2 结果

模型大鼠肝脏颜色变暗，部分表面呈颗粒状，边缘变钝，门静脉增粗. 肝组织HE染色可见肝小叶结构破坏，肝索排列紊乱，汇管区肝细胞炎性细胞浸润，肝组织见较为广泛的出血坏死透明肝细胞增多；胶原染色见明显宽大的纤维间隔或假小叶，肝窦内连续或断曰纷胶原沉积. 染毒后8wk末肝组织HE染色出血坏死减轻，但仍可见透明肝细胞，偶见透明肝细胞灶；胶原染色仍见明显的纤维间隔或假小叶.
模型大鼠ALT水平自2wk末开始升高，4wk末达高峰（P＜0.01），染毒停止后仍持续一定水平，3wk以后与正常组比有显著差异（P＜0.01），与2wk, 1wk末模型组比也有显著差异（P＜0.01）；总胆红素自造模2d出现异常，3wk, 4wk, 5wk达到高峰，AST水平在不同观察点均有升高趋势，清蛋白含量自2wk开始下降，5wk末最低，2wk, 3wk, 4wk, 5wk, 6wk, 8wk末与正常组比均有显著差异（P＜0.01），4wk, 5wk, 6wk末与2d末模型组比差异显著（P＜0.01），5wk末与wk1末模型组比也有显著差异（P＜0.01,表1）.

表1 DMN肝纤维化大鼠血清肝功能动态观察变化 (x±s)

t	组别	组数	清蛋白/mg·L^-1	ALT/U	AST/U	总胆红素/μmol·L^-1
2d	正常组	3	262±60	20.1±15.9	192.1±45.2	0.17±0.1
	模型组	6	242±74	28.2±17.7	249.2±37.2	0.49±0.7
1wk	正常组	3	352±54	42.1±10.5	185.3±55.7	0.24±0.04
	模型组	6	213±45^b	32.6±11.4	223.7±26.4	0.31±0.05
2wk	正常组	3	274±28	12.1±2.1	205.1±17.6	0.1±0.02
	模型组	6	191±28^b	65.8±19.2^bdf	230.3±7.5	0.68±0.7
3wk	正常组	3	285±34	48.3±7.4	184.8±78.7	0.07±0.03
	模型组	6	199±46^b	112.4±26.7^bdf	207.1±40.5	0.46±0.2^a
4wk	正常组	3	207±33	78±18.6	252.6±0	0.36±0.12
	模型组	6	165±34^bce	177.9±35.7^bdf	264.7±33.9	0.86±0.8^a
5wk	正常组	3	281