100023 北京市2345信箱 世界华人消化杂志  2001年6月15日;9(6):640-644
Email: wcjd@public.bta.net.cn 世界华人消化杂志  ISSN 1009-3079  CN  14-1260/R
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⊙研究原著⊙

分泌型抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体的构建及表达

程  虹1   刘彦仿1   张惠中2 沈万安2 张素珍1

1中国人民解放军第四军医大学基础部病理学教研室   陕西省西安市  710033
2中国人民解放军第四军医大学唐都医院骨科  陕西省西安市  710038
程虹，女，1967-06-24生，安徽省宣州市人，汉族. 1996年获第四军医大学病理学博士, 主要从事肝癌的免疫基因治疗研究.
项目负责人  程虹, 710033, 陕西省西安市长乐西路169号，中国人民解放军第四军医大学基础部病理学教研室.
Department of Pathology, Faculty of Preclinical Medicine, Fourth Military Medical University, Xi＇an  710033, Shaanxi Province, China
Correspondence to:Hong Cheng, Department of Pathology, Fourth Military Medical University, Xi＇an 710033,
Shaanxi Province, China
Tel. 0086-29-3577167(H), 3374541 Ext.324(O)
Email. chenghong@fmmu.edu.cn
Received  2001-02-06  Accepted  2001-02-12


Construction and expression of anti-HCC immunotoxin of sFv-TNF-α and GFP fusion proteins

Hong Cheng, Yan-Fang Liu, Hui-Zhong Zhang, Wan-An Shen and Su-Zhen Zhang


Abstract

AIM  To study the construction and expression of anti-HCC single-chain bifunctional antibody (sFv-TNF-α) and GFP fusion proteins.

METHODS  A single-chain antibody (sFv) gene comprising the linked heavy and light chain variable regions derived from a monoclonal antibody with high specifity and affinity binding to hepatocellular carcinoma (HCC) were first added leader sequence by polymerase chain reaction (PCR) and then fused inframe with human tumor necrosis factor-α (TNF-α) gene. The recombinant sFv-TNF-α gene was cloned into an expression vector pEGFP-N3 containing the report gene of GFP, and the recombinant vector was first identified with enzyme digestions for the correct insertion and further confirmed by DNA sequence analysis. To investigate whether mammalian cells could produce fusion protein, NIH3T3 cells were transfected with the plasmid pEGFP-ST by Calcium Phosphate method.

RESULTS The recombinant vector was identified with enzyme digestions for the correct insertion and further confirmed by DNA sequence analysis. Bright green fluorescence in the cytoplasm of the transfected NIH3T3 cells was observed under the fluorescence microscope 20 hours after transfection of the recombinant vector.

CONCLUSION  The gene of single-chain bifunctional antibody was constructed. The fusion proteins of anti-HCC single-chain bifunctional antibody and GFP were successfully expressed in NIH3T3 cells.   It is suggested that mammalian cells can express antibody-cytokine fusion proteins, which may be theoretically necessary for our next step of study in a gene therapy.
Subject headings  hepatocellular carcinoma; single-chain antibody; tumor necrosis factor-α; green fluorescent protein; gene expression

Cheng H, Liu YF, Zhang HZ, Shen WA, Zhang SZ. Construction and expression of anti-HCC immunotoxin of sFv-TNF-α and GFP fusion proteins. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 2001;9(6):640-644


摘要

目的  分泌型抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体的构建及表达.

方法  采用PCR方法在抗肝癌sFv的5＇端引入引导序列使其能够在真核细胞中表达并分泌，在其下游连接人TNF-α基因，构建分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因，并将该基因克隆入带有GFP报告基因的真核表达载体，用磷酸钙共沉淀法转染小鼠成纤维细胞NIH3T3进行瞬时表达.

结果  DNA序列分析证实在sFv 的5＇端引入正确的60bp引导肽序列, 酶切鉴定证明成功构建了分泌型抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体，并在NIH3T3细胞中成功地表达了融合荧光蛋白.

结论  成功构建并表达了分泌型抗肝癌单链双功能抗体融合GFP基因，为肝癌免疫基因治疗的进一步研究奠定了基础.


主题词  肝细胞癌;单链抗体(sFv); 肿瘤坏死因子(TNF-α); 绿色荧光蛋白(GFP); 基因表达


程虹, 刘彦仿, 张惠中, 沈万安, 张素珍. 分泌型抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体的构建及表达.
世界华人消化杂志，2001；9(6)：640-644


0  引言

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)恶性程度极高，在我国有着较高发病率和死亡率［1-4］，迄今尚无理想的治疗手段［5-14］. 随着现代分子生物学和免疫学的发展，基因工程抗体的诞生为肿瘤的诊断和治疗带来了希望［15-17］，尤其是单链抗体的应用成为肿瘤免疫基因治疗的热点［18,19］. 我室曾成功构建并高效原核表达了抗肝癌sFv，体外免疫细胞化学实验表明，其对肝癌细胞具有明确的反应［20,21］. 我们用PCR方法在该sFv 的5＇端引入引导序列使其能够在真核细胞中表达并分泌，在其下游连接人肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor-α, TNF-α)基因，构建分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因，并将该基因克隆入带有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）报告基因的真核表达载体，在小鼠成纤维细胞NIH3T3中瞬时表达sFv-TNFα-GFP融合蛋白，以便灵敏、直观、有效地观察目的基因在真核细胞中的表达，为肝癌免疫基因治疗的进一步研究奠定了基础.

1  材料和方法

1.1  材料  pEGFP-N3质粒（内含GFP基因）由赵利军博士惠赠，抗肝癌sFv基因为本室构建，TNF-α基因由孙志伟博士惠赠. 大肠杆菌JM109，pGEM-T载体和磷酸钙转染试剂盒购自Promega公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶、X-gal及IPTG购自Gibco公司；PCR引物由上海生物工程公司合成.

1.2  方法

1.2.1  PCR引物的设计与合成  根据本实验室克隆抗肝癌sFv的cDNA序列，Oligo软件优化设计出上、下游引物，在sFv的5＇端引入酶切位点EcoRⅠ和引导肽基因序列，3＇端引入酶切位点SalⅠ. 由于引导肽基因序列较长，故设计了一对上游引物，通过两轮PCR反应来引入完整引导序列. 根据人TNFα的cDNA序列，Oligo软件优化设计出上、下游引物，两端分别引入SalⅠ和SacⅡ位点. 所有引物均由上海生物工程有限公司合成，序列如下：
    SFv下游引物:   sFv-1: 5＇CCGTCGACACGT-TTGATCTCGACCTTGG3＇
      SFv上游引物:   sFv-2: 5＇GTTTTAAAAGGT-GTCCAGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCGG3＇ 
      sFv-3: 5＇CTGAATT-CATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGCCAGTG3＇
      引导肽基因序列：ATGAACTTCGGGCT-CAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGCCAGTGT  引自Peter Buckel,1987 (Gene,1987; 51:13-19).
       TNFα下游引物:  TNFα-1: 5＇TCCCCGCGGCAG-GGCAATGACCCCAAAGTAG3＇
     TNFα上游引物:  TNFα-2: 5＇CCGTCGACGTCA-GATCATCTTCTCGAAC3＇

1.2.2  sFv和TNF-α基因片段的扩增  以质粒pGEX-sFv为模板，用引物sFv-1和sFv-2进行第1轮PCR反应，15g·L-1琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，低熔点琼脂糖凝胶回收760bp大小的条带，WizardTM Minicolumn 纯化(按试剂盒提供方法进行). 再以纯化的第1轮PCR产物为模板，sFv-1和sFv-3为引物进行第2轮PCR反应，循环结束后，同样方法分离、回收、纯化PCR产物中790bp大小的条带，-20℃保存备用. 以PET-TNF-α为模板，用引物TNFα-1和TNFα-2进行PCR扩增. 15g·L-1琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，低熔点琼脂糖凝胶回收470bp大小的条带，WizardTM Minicolumn纯化. 循环参数为：94℃ 60s，58℃ 60s，72℃ 90s，共30个循环，72℃保温10min.

1.2.3  sFv和TNF-α基因片段的克隆［22］和鉴定  sFv和TNF-α的PCR产物纯化后分别连入pGEM-T载体，连接反应体系为：PCR产物5μL，pGEM-T载体1μL, 10×连接反应缓冲液1μL，T4DNA连接酶1μL, 16℃连接反应16h. 连接产物分别命名为pGEM-sFv和pGEM-TNFα. 参照《分子克隆操作指南》制备JM109感受态宿主菌，冰浴条件下分别加入上述连接产物，冰浴30min， 42℃热休克90s后，迅速冰浴2min,加LB培养液800μL，37℃保温1h，涂于氨苄青霉素抗性的X-gal/LB平板进行蓝白筛选，37℃培养过夜. 分别随机挑取上述连接产物转化的10个白色菌落，扩大培养，提取质粒并分别用pGEM-T载体中外源基因插入位点两侧sacⅡ，pstⅠ双酶切鉴定，酶切产物于15g·L-1琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外射仪上观察结果.择酶切鉴定符合的克隆作为阳性克隆，Qiagen20 TIP纯化质粒(按Qiagen公司试剂盒说明操作)，用通用引物Dye Primer(M13RP1)（上游：AACAGCTATGACCATG，下游：TGACCGGCAGCAAAATG）进行双向测序.

1.2.4  双功能抗体基因与GFP基因融合表达载体的构建和鉴定  pEGFP-N3质粒用SalⅠ和SacⅡ双酶切，15g·L-1琼脂糖凝胶电泳，低熔点琼脂糖凝胶回收并纯化4.7kb大小的线性化载体片段，pGEM-TNF质粒用SalⅠ和SacⅡ双酶切，15g·L-1琼脂糖凝胶电泳，低熔点琼脂糖凝胶回收470bp大小的TNF-α片段，回收TNF-α片段. 将纯化的TNF-α酶切片段5μL与线性化pEGFP-N3载体片段1μL于16℃连接反应16h，连接产物命名为pEGFP-TNF. 转化JM109感受态宿主菌，涂于卡那霉素抗性的LB平板上，37℃培养过夜. 随机挑取12个单菌落，扩大培养，小量提取质粒，用SalⅠ和SacⅡ双酶切鉴定，15g·L-1琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外透射仪上观察结果. 选择酶切鉴定的pEGFP-TNF阳性克隆扩大培养，提取质粒，用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切并回收5.2kb大小的线性化载体片段，pGEM-sFv用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切并回收790bp大小的sFv片段，取载体片段1μL和sFv酶切片段5μL进行连接反应，连接产物命名为pEGFP-ST, 即为单链双功能抗体和GFP融合表达的真核表达载体. 将上述连接产物转化 JM109感受态宿主菌，涂于卡那霉素抗性的LB平板上，37℃培养过夜. 随机挑取12个单菌落，扩大培养，小量提取质粒，用EcoRⅠ和SacⅡ切割sFv-TNF-α片段及SalⅠ和SacⅡ切割TNF-α片段，分别进行双酶切鉴定，15g·L-1琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外透射仪上观察结果.

1.2.5  重组双功能抗体-GFP融合蛋白的真核表达活化重组pEGFP-ST宿主菌JM109单个菌落，接种于3mL LB培养液中培养过夜. Qiagen20 Tip纯化质粒，溶于30μL无菌水中，-20℃保存备用. 于转染前1d，用2.5g·L-1蛋白酶消化小鼠成纤维细胞NIH3T3，将6×105细胞接种于90mm培养皿中. 转染前4h换10mL含100mL·L-1小牛血清的DMEM培养液，置37℃，50mL·L-1 CO2孵箱培养. 严格按照磷酸钙转染试剂盒说明，将20μg纯化重组pEGFP-ST质粒DNA溶于无菌水中，总体积为438μL，加入2mol·L-1 CaCl2  62μL混匀，缓慢滴入2×HBS 0.5mL中. DNA-磷酸钙共沉淀物置室温30min，逐滴加至接种NIH3T3细胞的培养皿中，置37℃，50mL·L-1 CO2孵箱培养12h，换完全DMEM培养液继续培