100023 北京市2345信箱 世界华人消化杂志  2000年8月15日;8(8):887-891
Email: wcjd@public.bta.net.cn 世界华人消化杂志  ISSN 1009-3079  CN  14-1260/R
http:// www.wjgnet.com 版权归世界胃肠病学杂志社

⊙研究原著⊙

大肠癌CD15, CD44v6和nm23H1的mRNA表达与转移
及预后的相关性

谷化平1   倪灿荣2   詹熔洲2

1 中国人民解放军251医院病理科  河北省张家口市  075000
2 中国人民解放军第二军医大学病理教研室  上海市  200433
谷化平，男，1949-11-01生，安徽省濉溪县人，汉族. 1974年河北医学院大专毕业，副主任医师，发表论文160篇，获军队科技进步奖6项. 目前主要从事CD15抗原在肿瘤表达的临床病理研究.
项目负责人  谷化平,075000, 河北省张家口市建国路13号，中国人民解放军251医院病理科.
 1Department of Pathology, Chinese PLA 251 Hospital, Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China 
 2Department of Pathology, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
Correspondence to Hua-Ping Gu, Department of Pathology, Chinese PLA 251 Hospital, 13 Jianguo Avenue,
Zhangjiakou 075000, Hebei Province, China 
Tel. 0086-313-2013791 Ext.83702
收稿日期  2000-04-24  接收日期  2000-05-16


Relationship of expressions of CD15, CD44v6 and nm23H1 mRNA with metastasis and prognosis  of  colon  carcinoma

Hua-Ping Gu1, Can-Rong Ni2 and Rong-Zhou Zhan2


Abstract

AIM  To study the expressions of CD15, CD44v6 and nm23H1 mRNA in colon carcinoma, and to investigate the correlation of CD15 mRNA expression with the clinicopathological parameter and prognosis of colon carcinoma.

METHODS  In situ hybridization was used to detect the expressions of CD15 mRNA, CD44v6 mRNA and nm23H1 mRNA in 90 cases of colon carcinoma, and the expressions of CD15 mRNA in 20 cases of matched primary and metastastic colon carcinoma samples. The study was combined with analysis of 53 cases of follow-up surveys for more than 5 years.

RESULTS  In 90 cases of colon carcinoma, the expressions of CD15 mRNA, CD44v6 mRNA and nm23H1 mRNA were 84.4%, 68.9% and 6.7%, respectively. The high level expression of CD15 mRNA and CD44v6 mRNA and the low level expression of nm23H1 mRNA were positively correlated with the Duke＇s staging，serosa infiltration，lymph node and liver metastasis of colon carcinoma. The expression of CD15 mRNA in colon carcinoma was positively associated with that of CD44v6 mRNA and negatively with that of nm23H1 mRNA.  CD15 mRNA expression was consistent  in 20 cases of matched primary and metastatic colon carcinoma samples.

CONCLUSION  The invasiveness and metastasis of colon carcinoma were closely associated with the synergistic action of several genes. CD15 mRNA, CD44v6 mRNA and nm23H1 mRNA play an up-regulating and a down-regulating role, and had a synergistic action in metastasis of colon carcinoma. CD15 mRNA could be a new biological index to predict the invasive potential of colon carcinoma and objectively evaluate the prognosis of patients.

Subject headings  colorectal neoplasms; neoplasms metastasis; cell adhesion molecules; in situ hybridization; prognosis;
biologicacl markers

Gu HP, Ni CR, Zhan RZ. Relationship of expressions of CD15, CD44v6 and nm23H1 mRNA with metastasis and prognosis of colon carcinoma. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 2000;8(8):887-891 


摘要

目的  探讨CD15，CD44v6和nm23H1的mRNA表达与大肠癌临床病理参数和预后的关系及相关性.

方法  应用原位杂交检测90例大肠癌中CD15，CD44v6和nm23H1的mRNA表达及20例原发灶和转移灶大肠癌配对标本中CD15 mRNA表达，并结合53例5a以上随访资料分析.

结果  90例大肠癌中CD15，CD44v6和nm23H1的mRNA阳性表达分别为76例（84.4%），62例（68.9%）和60例（66.7%）. CD15和CD44v6的mRNA高表达及nm23H1 mRNA低表达与大肠癌Duke＇s分期、浆膜浸润、淋巴结转移、肝脏转移均呈正相关. 大肠癌中CD15 mRNA表达与CD44v6 mRNA表达呈正相关，与nm23H1 mRNA表达呈负相关. 20例原发灶和转移灶大肠癌配对标本中，CD15 mRNA表达水平一致.

结论  大肠癌的侵袭转移与相关基因协同作用密切相关. 在大肠癌的侵袭转移中CD15，CD44v6和nm23H1的mRNA表达具有正、负调节的协同作用可能. CD15 mRNA可作为一个新的准确预测大肠癌侵袭转移潜能，并客观评估患者预后的生物学指标.

主题词  结肠直肠肿瘤；肿瘤转移；细胞粘附分子；原位杂交；预后；生物学标记

谷化平, 倪灿荣, 詹熔洲. 大肠癌CD15, CD44v6和nm23H1的mRNA表达与转移及预后的相关性. 世界华人消化杂志，2000；8(8)：887-891


0  引言

大肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，其主要死亡原因是术后转移. 由于临床上尚无可靠的方法预测，故而使转移的早期诊断和有效防治显得力不从心. 因此，探究大肠癌转移的分子机制，寻找与大肠癌转移相关的生物学标志多年来一直是大肠癌基础与临床研究的主题之一. 近年来发现细胞粘附分子（cell adhesion molecules,CAM）CD15（Lewis X）表达与许多肿瘤的发生发展、侵袭转移和患者预后密切相关，被视为具有肿瘤转移潜能和预后不良的独立生物学指标［1-18］. 我们应用原位杂交（Insitu hybridization,ISH）CSA方法，对90例大肠癌进行CD15,CD44v6和nm23H1的mRNA检测，结合5a以上53例随访资料分析，探讨CD15 mRNA表达与大肠癌临床病理参数，ず蟮墓叵导坝隒D44v6和nm23H1的mRNA表达之间的相关性，评价CD15 mRNA可否作为一个可靠预测大肠癌转移潜能和预后的新的生物学指标.

1  材料和方法

1.1  材料  解放军251医院和第二军医大学长海医院大肠癌术后标本90例，并经100mL·L-1中性甲醛固定，HE切片病理确诊. 90例大肠癌术后进行5a以上随访，回访53例. 90例大肠癌的临床病理参数见表1. BT（生物素化酪胺分子）和CSA kit均购自丹麦Dako公司. 生物素化抗Dig二抗、末端标记和Sp6/T7体外转录标记盒购自德国宝灵曼公司. nm23H1 cDNA质粒（PGEH-42）由陈晓东博士转赠. CD44v6 cDNA由Ursula Gunthert博士惠赠. CD15寡核苷酸探针由中科院上海细胞所按文献报道核苷酸序列［19］DNA固相合成仪合成.

1.2  方法  CD15 cDNA寡核苷酸探针按末端标记试剂盒说明书操作，标记上Dig. CD44v6 cDNA  载体质粒PGEX-2T中CD44V2-V10，cDNA插入EcoRⅠ酶切位点；探针由PCR合成，标记上生物素，CD44v6引物按文献［20］设计. nm23H1 cDNA质粒（PGEH-42）经转化扩增，抽提后得到的质粒DNA经酶切使线性化，回收DNA片段；按Sp6/T7体外转录标记kit说明书操作，并标记上Dig. 新鲜组织标本用4g·L-1多聚甲醛固定（以下一切均用DEPC水处理）24h，新鲜系列乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4μm厚连续切片，贴在涂有切片粘合剂（1g·L-1多聚赖氨酸）的载玻片上，58℃烤片24h. 常规脱蜡至水，PBS洗，20mg·L-1蛋白酶K 37℃ 20min，PBS洗3×3min，0.2×SSC洗2×5min. 用4g·L-1多聚甲醛后固定10min，系列乙醇脱水，PBS洗3×3min，0.2×SSC洗2×5min. 杂交和检测按文献［21］报道操作. H2O2-DAB显色. ISH阳性对照均按Gen  Point kit内配置阳性切片为标准. 经RNAase消化1h后，作杂交为阴性对照. 杂交液中不加探针结果为阴性. ISH染色阳性信号呈棕黄色. 根据染色强度及显色癌细胞比例将染色结果分为-,+,++三级： ①按切片中细胞显色有无及深浅评分：无显色为0分，棕黄色为1分；棕褐色为2分. ②根据显色癌细胞的比例记分：＜30％为1分；31%～71％为2分；＞71％为3分. 每例肿瘤的积分-①＋②，按积分高低分为：0分为阴性（-），1～3分为弱阳性（4～6分为强阳性（＋＋）.
       统计学处理  采用χ2检验.

2  结果

2.1  CD15，CD44v6和nm23H1的mRNA表达与大肠癌病理参数的关系 ISH显示，CD15，CD44v6和nm23H1的mRNA阳性表达产物呈棕黄色或棕黄色颗粒或团块状，位于大肠癌细胞膜和细胞质内（图1，2，3）. 90例大肠癌中，三者阳性表达分别为76例（84.4%），62例（68.9）和60例（66.7%），均与大肠癌肿瘤部位，肿瘤大小和组织类型无关. CD15和CD44v6的mRNA高表达及nm23H1 mRNA低表达与大肠癌Dukes分期、浆膜浸润、淋巴结转移、肝脏转移均呈正相关（表1）. 20例原发和淋巴结及肝脏转移灶大肠癌配对标本中，CD15的mRNA表达水平一致.

图1  大肠癌组织CD15寡核苷酸探针染色阳性. CSA-ISH法×200

图2  大肠癌组织CD44 cDNA探针-b染色阳性. CSA-ISH法×200

图3  大肠癌组织nm23 cRNA探针-DIG染色阳性. CSA-ISH法×200

2.2  CD15，CD44v6和nm23H1的mRNA表达与大肠癌预后  对90例大肠癌根治术患者进行术后随访满5a以上，回访53例（58.9%）. 其中5a内复发、淋巴结及肝脏转移35例，无复发转移18例. 5a内死亡21例，＞5a存活32例. 结果显示，CD15和CD44v6的mRNA阳性表达者术后5a复发转移率高，5a内存活率低，而nm23H1的mRNA阳性表达者术后5a复发转移率低，5a内存活率高（表2）.

2.3  CD15的mRNA表达与CD44v6和nm23H1的mRNA表达的关系  大肠癌90例中，CD15 mRNA表达与CD44v6 mRNA表达呈正相关，与nm23H1 mRNA表达呈负相关（表3）. 



3  讨论

由细胞表面的CAM所介导的细胞与细胞或细胞与细胞外基质之间的作用，是恶性肿瘤形成、侵袭和转移的生物学基础. CD15属CAM成员，为选择素（selectin）CAM家族所识别的比较确定的配体，它可以诱导血管内皮细胞粘附，与内皮细胞上的选择素A结合，介导肿瘤细胞与基质成分或内皮细胞相关受体结合，从而在肿瘤的侵袭和转移过程中起着关键性作用［1-4］. 近年来通过食管癌、胃癌、胆囊癌、甲状腺癌、乳腺癌、膀胱癌及头颈部鳞状细胞癌等许多肿瘤的研究证实，CD15增强表达常出现在细胞的致癌和肿瘤的进展过程中，CD15阳性表达的肿瘤侵袭性强，转移及复发率高，患者存活率低［3-17］. CD15在大肠癌的研究已受到重视. Nakagoe et al［13］报道120例结直肠CD15免疫组化表达，其中87例（72.5%）呈阳性反应，而CD15表达阳性肿瘤患者的5a生存率（60.6%）显著低于CD15表达阴性肿瘤患者的5a生存率（81.2%），并证实CD15表达越强烈者5a生存率越低. Bresalier et al［1］和Yamaguchi et al［2］也研究证实，CD15阳性表达与结直肠癌的侵袭和转移呈正相关，CD15表达阳性的肿瘤复发率高，患者预后最差. 我们曾采用免疫组织化学，图象分析和金标免疫电镜方法研究发现，CD15表达的质、量和抗原定位改变均与大肠癌的发生发展、浸润转移及患者预后密切相关［16-18］. 我们研究结果显示，CD15 mRNA阳性表达产物定位大于肠癌细胞膜和细胞质内. 90例大肠癌中CD15 mRNA阳性表达76例（84.4%）. CD15 mRNA阳性表达率在Dukes分期C～D期中显著高于A～B期，有浆膜浸润、淋巴结转移、肝脏转移的肿瘤显著高于无浆膜浸润、无淋巴结转移及肝脏转移的肿瘤. 在20例原发灶和淋巴结及肝脏转移灶配对标本中，CD15 mRNA表达水平一致. 结合临床随访资料分析，CD15 mRNA表达阳性的肿瘤5a复发转移率高，5a生存率低. Kerbel［22］报道，具有转移潜能的亚克隆细胞在原发癌灶发生的早期即具有生长优势,这种生长优势是由于转移性亚克隆细胞群体可分泌某种特殊因子或对局部细胞生长因子具有特殊反应而呈现的选择性生长所决定的. 认为检测原发肿瘤标本中某些肿瘤分子标志的水平有可能反应出整个肿瘤的一般转移特性. 根据本结果提示，在大肠癌原发灶中CD15 mRNA阳性表达的细胞可能就是具有转移能力的亚克隆细胞，随着肿瘤的进展，这种表达CD15 mRNA的亚克隆细胞通过与其周围细胞、间质细胞或内皮细胞的粘附介导作用，即具有转移潜能而在生长中逐渐占据优势并发生转移. 我们认为，检测CD15 mRNA表达对预测原发肿瘤的转移潜能及评估患者预后方面具有较大实用价值.
      CD44是细胞表面的整合膜蛋白，属CAM家族. CD44v6是CD44的一个拼接变异体，主要出现在机体的病理过程，特别是肿瘤的发生发展过程中. CD44v6的出现可改变肿瘤细胞表面CAM的构成和功能，使肿瘤细胞侵袭和转移能力增强. 近年来发现，CD44v6的过量表达与结肠癌、胃癌、食管癌及恶性黑素瘤等许多肿瘤的发生发展，侵袭转移及预后不良密切相关［23,24］. nm23H1基因定位于17q21.3-22，包含5个外显子和4个内含子，编码核苷二磷酸激酶（NDPK）. nm23H1基因的改变可发生在DNA，mRNA及蛋白3个不同层次. 对nm23H1 mRNA和蛋白表达的研究表明，在人类肿瘤如大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌及肺癌等中，nm23H1 mRNA或蛋白的表达与肿瘤的转移及临床预后不良呈负相关. Tannapful et al［25,］报道，检测肿瘤nm23H1表达对预测大肠癌淋巴结转移的敏感性93％，特异性58％. 认为检测nm23H1蛋白表达对预测结直肠癌肝转移、淋巴结转移都具有一定意义. 我们采用ISH方法检测90例大肠癌中CD44v6 mRNA和nm23H1 mRNA表达，其阳性率分别为69.9％和66.7％. CD44v6 mRNA高表达和nm23H1 mRNA低表达的肿瘤5a复发转移率高，5a存活率低. 表明CD44v6 mRNA具有促进、nm23H1 mRNA具有抑制大肠癌侵袭转移的能力. 检测其表达对预测大肠癌转移潜能和评估患者预后都具有重要实用价值.
     恶性肿瘤的形成和转移的发生是一个多基因、多因子共同作用的结果. 近年来在恶性肿瘤发生的癌基因研究中，不少学者提出多基因协同作用假说，认为在肿瘤发生发展和转移的各阶段，至少有两个或两个以上功能不同的异常激活的癌基因各自发挥不同作用，并在时间和空间上相互配合，协同促进了细胞的癌变. 我们发现，在大肠癌中CD15 mRNA表达与CD44v6 mRNA表达呈正相关，与nm23H1 mRNA表达呈负相关. 结果提示：在促进大肠癌的侵袭转移过程中，CD15 mRNA表达与CD44v6及nm23H1的mRNA表达具有正、负调节的协同作用可能. 其机制均有待进一步探讨.

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