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100023 北京市2345信箱	世界华人消化杂志 2000年7月15日;8(7):755-758
Email: wcjd@public.bta.net.cn	世界华人消化杂志 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R
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⊙研究原著⊙

定量PCR检测慢性乙型肝炎患者HBV-DNA及其意义

王平忠¹ 张中伟² 周永兴¹ 白雪帆¹

¹中国人民解放军第四军医大学唐都医院传染科 陕西省西安市 710038 ²西安铁路分局卫生防疫站陕西省西安市 710054
王平忠，男，1963-03-04生，陕西省汉中市人，汉族. 1984年汉中师范学院生物学系毕业，1997年西北大学生物学系获硕士学位，主要从事分子生物学研究，发表论文4篇.
项目负责人 王平忠，710038，陕西省西安市，中国人民解放军第四军医大学唐都医院传染科.¹Department of Infectious Diseases, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, 
Xi＇an 710038, Shaanxi Province, China²Hygienic Epidemic Prevention Station of Xi＇an Railway Branch Office,Xi＇an 710054, Shaanxi Province, China
Correspondence to Ping-Zhong Wang, Department of Infectious Diseases, Tangdu Hospital,
Fourth Military Medical University, Xi＇an 710038, Shaanxi Province, China
Tel. 0086-29-3577595
Email. Didthx@fmmu.edu.cn
收稿日期 2000-05-25 接收日期 2000-06-02

Quantitative PCR detection of HBV-DNA in patients with chronic hepatitis B and its significance

Ping-Zhong Wang¹, Zhong-Wei Zhang², Yong-Xing Zhou¹ and Xue-Fan Bai¹

Abstract

AIM To understand the viral quantity of chronic hepatitis B patients with positive e antigen and positive anti-HBe and the relationship between the different pathological change levels of chronic hepatitis B and HBV quantity infected.HBV-M was detected by ELISA in 89 chronic hepatitis B patients. Thirty HBeAg(+)/HBeAb(-) sera and 30 HBeAg(-)/HBeAb(+) sera were selected from ELISA results. Their HBV-DNA quantities were determined using AmpliSensor PCR quantitative method. Serum level of ALT was detected using full automatic biochemical analysis. The HBV-DNA quantity and serum ALT level of each group was calculated by calculating the arithmetic mean value.

RESULTS The mean quantity of HBV-DNA was 11.21±6.92 E copies／L in 30 HBeAg(+)/HBeAb(-) sera. 9.73±5.61 E copies/L in 22 HBeAg(-)/HBeAb(+) sera. There was significant difference between the HBeAg positive patients and anti-HBe positive patients (P＜0.05). The mean quantity of HBV-DNA was 10.93±6.22 E copies/L in 17 mild chronic hepatitis B patients 9.84±6.06 E copies/L in 23 moderate chronic hepatitis B patients and 8.72±5.62 E copies/L in 12 severe chronic hepatitis B patients, respectively, difference being significant between the mild chronic hepatitis B and the severe chronic hepatitis B (P＜0.05). Serum ALT level had neither concordant relationship with pathological changes of liver tissue. Nor obvious correlation with HBV-DNA amount.

CONCLUSION HBV-DNA still replicated continuously in most of anti-HBe positive patients. The viral quantity in anti-HBe positive sera was lower than that in HBeAg positive sera. The mean amount of HBV-DNA had an inverse ratio to the pathological change level. The inflammatory level of liver appears to be an indirect index in estimating viral quantity.

Subject headings chronic hepatitis B; HBV-DNA quantity; quantitative PCR; e antigen positive; anti-HBe positive; ELISA

Wang PZ, Zhang ZW, Zhou YX, Bai XF. Quantitative PCR detection of HBV-DNA in patients with chronic hepatitis B and its significance. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 2000;8(7):755-758

摘要

目的了解慢乙肝患者抗-HBe阳性和e抗原阳性血清的病毒量及不同病变程度的慢乙肝与HBV感染量的关系. 了解HBV-DNA含量和血清ALT水平之间的关系.

方法临床确诊的89例慢乙肝患者，经ELISA测定后，选取30例HBeAg(+)/HBeAb(-)血清和30例HBeAg(-)/HBeAb(+)血清，采用AmpliSensor PCR定量技术，测定HBV-DNA. 使用全自动生化分析仪，测定血清ALT水平. 各组HBV-DNA含量和ALT水平用求算术平均值的方法计算.

结果 HBeAg(+)/HBeAb(-)血清30例，HBV-DNA平均含量为(11.21±6.92)E拷贝/L；HBeAg(-)/HBeAb(+)血清22例，HBV-DNA平均含量为(9.73±5.61)E拷贝/L，两组具有显著差异(P＜0.05). 轻度慢性乙肝17例，HBV-DNA平均含量为(10.93±6.22)E拷贝/L；中度慢性乙肝23例，HBV-DNA平均含量为(9.84±6.06)E拷贝/L；重度慢性乙肝12例，HBV-DNA平均含量为(8.72±5.62)E拷贝/L. 轻、重度组间HBV-DNA平均含量有显著差异(P＜0.05). 血清ALT水平与肝组织病变程度无一致关系，与HBV-DNA含量亦无明显相关.

结论多数抗-HBe阳性患者HBV仍持续复制，血清病毒量低于HBeAg(+)者. 慢乙肝病变程度与HBV-DNA平均拷贝数成反比. 肝脏炎症程度似可作为估计病毒量的间接指标.

主题词 慢性乙型肝炎；HBV-DNA；定量PCR；e抗原阳性；e抗体阳性；ELISA

王平忠, 张中伟, 周永兴, 白雪帆. 定量PCR检测慢性乙型肝炎患者HBV-DNA及其意义. 世界华人消化杂志，2000；8(7)：755-758

0 引言

慢性HBV感染者的临床谱可从无症状携带状况、慢性肝炎到肝硬变、肝癌^［^1-6^］. 血清HBeAg(+)是病毒复制活跃的标志，而HBeAg(+)转换成HBeAb(+)通常表示病毒的免疫清除和病变的静息. 但在绝大多数HBeAb(+)的慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者血清中仍可检出HBV-DNA^［^7-13^］，使感染持续，出现病毒血症. 因此，在HBeAb血清转换后，病毒含量水平一直为人们所关注. 近年来，随着分子诊断概念的发展，在病毒基因定量方面设计出了几种定量PCR方法^［^14-17^］，为定量观察病毒开辟了新的途径. 我们采用AmpliSensor PCR定量技术，测定了60例慢乙肝患者血清HBV-DNA拷贝数，并对不同病变程度的慢乙肝HBV-DNA含量进行了比较，以了解慢乙肝患者HBeAg(+)和HBeAb(+)血清的病毒量、不同病变程度慢乙肝与HBV感染量以及HBV睤NA含量与血清ALT水平间的关系，对于深入研究乙肝的临床特征和指导治疗有重要意义.

1 材料和方法

1.1 材料 1999-09/1999-12我科收治的不同病变程度慢性乙型肝炎89例. 经ELISA测定后，选取HBeAg(+)/HBeAb(-)和HBeAg(-)/HBeAb(+)血清各30例(慢性轻度20例，中度26例，重度14例). 其中，男43例，女17例，年龄16岁～73岁. 所有病例仅为HBV感染且HBsAg阳性.主要试剂：①不对称扩增引物及信号扩增引物：由美国Biotronics公司提供. 不对称扩增引物为：P1 5＇-TGCTCGTGTTACAGGCGGGGT-3＇； P2 5＇-GAGGCATAGCAGCAGGATGAAGAG-3＇. 扩增产物为HBV S基因区编码的241bp片段. 信号引物为：5＇-TCGCTGGAAGTGTCTGCGGCG-3＇. 扩增产物为不对称扩增产物内长度为64bp片段. ②纯化HBV-DNA(阳性梯度对照)、 dNTP及DNA抽提试剂均由美国Biotronics公司提供. ③Taq酶为Promega公司产品. ④ELISA试剂由上海科华实业有限公司提供.

1.2 方法 HBV-DNA定量分析，采用AmpliSeneor PCR定量方法. 主要有以下过程：①HBV-DNA提取：按操作说明书进行. ②不对称扩增：取提取的上清液5μL，加不对称扩增反应混合液10μL(含不对称扩增引物P1，P2，dNTP，Taq酶及PCR缓冲液)，先预变性90℃ 20s，然后94℃ 25s，60℃ 25s，72℃ 30s，扩增20个循环，最后72℃延伸30s. ③信号扩增：在不对称扩增产物中加信号扩增混合液(含信号扩增引物及PCR缓冲液)5μL，然后按上述条件循环，每两个循环读数一次. ④HBV-DNA定量：使用AG-9600荧光DNA分析仪(美国)，并依据纯化HBV-DNA建立直线回归方程，通过计算机，采用ASAP专用软件自动分析，直接读取HBV-DNA初始模板数. 每次实验按要求各设阳性对照、阴性对照和最大信号对照. 定量结果统计及分析，采用求算术平均值的方法来计算各组HBV-DNA 平均含量，阴性结果不参加平均值统计. t检验用于显著性分析.

2 结果

2.1 HBeAg(+)/HBeAb(-)和HBeAg(-)/HBeAb(+)血清HBV-DNA含量慢乙肝患者血清60例，经定量PCR检测，共检出HBV-DNA阳性52例，总阳性率86.7%，其中，HBeAg(+)/HBeAb(-)血清30例全部阳性，平均拷贝数(11.21±6.92)E拷贝/L；HBeAg(-)/HBeAb(+)血清30例，22例阳性，阳性率73.3%，平均拷贝数(9.73±5.61)E拷贝/L. 两组HBV-DNA含量见图1.

图1 HBeAg(+)和HBeAb(+)血清HBV-DNA含量.1. HBeAg(+)； 2. HBeAb(+)；图中HBV-DNA拷贝数为对数值. 1vs2 P＜0.05.

2.2 不同病变程度慢乙肝HBV-DNA含量与血清ALT之间的关系 按病变不同程度，将60例患者划分为轻、中、重度慢乙肝，HBV-DNA含量见表1. 不同病变程度慢乙肝、血清ALT水平无显著差异(P＞0.05). HBV-DNA量与ALT水平无一致关系.

表1 不同病变程度的慢乙肝HBV-DNA含量和ALT水平（x±s)

慢乙肝	n	DNA阳性数(%)	DNA含量(E拷贝/L)*	丙氨酸转氨酶(U/L)
轻度	20	17(85.0)	10.93±6.22	258.9±216.4
中度	26	23(88.5)	9.84±6.06	369.1±321.3
重度	14	12(86.7)	8.72±5.62^a	326.7±276.2
合计	60	52(86.7)

*拷贝数为对数值. ^aP＜0.05，vs 轻度.

3 讨论

目前，比较成熟的基因定量技术可分为两大类，即分子杂交和PCR法. PCR定量技术因其极高的灵敏度已成为临床基因诊断的重要手段. 但是，从早期的斑点杂交法^［^18，19^］，bDNA法^［²⁰^］，到竞争性PCR^［²¹^］，PCR-ELISA^［²²^］等，困扰临检人员的一致有两大难题，即定量的准确度和PCR的假阳性污染. 本研究采用的AmpliSensor PCR定量技术，是在PCR扩增过程中加入荧光素标记的特异性引物，随着DNA扩增，荧光能量发生转移，荧光强度减弱，经25～40个循环后，PCR反应体系中的荧光强度与扩增产物的量有关，而扩增产物的量又与原始模板的量即待测标本中HBV-DNA拷贝数有关，从而达到定量的目的. 该方法属封闭式定量PCR分子扩增系统，免除了样本污染机会. 另一优点是在扩增过程可进行实时在线定量阅读，并能选择理想的循环次数作出精确的定量分析. 因此，该定量技术一举解决了上述两大难题. 但该方法是基于外参的定量技术，反应管间及扩增效率方面的差异可能导致准确性下降.
我们采用上述方法检测了60例慢乙肝患者血清标本，结果52例HBV-DNA(+)，8例阴性，最高拷贝数1012.3 拷贝/L(12.3 E拷贝/L). 全部病例若按＞10E拷贝/L、8～10E拷贝/L和＜8E拷贝/L将病毒量分为高、中、低三度，则高滴度16例(30.8%)，中等滴度24例(46.2%)，低滴度12例(23%). 在HBV