100023 北京市2345信箱 世界华人消化杂志  2000年6月15日;8(6)708-709
Email: wcjd@public.bta.net.cn 世界华人消化杂志  ISSN 1009-3079  CN  14-1260/R
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⊙研究快报⊙

抗肝癌单链双功能抗体基因逆转录病毒表达载体
的构建及病毒包装细胞系的建立

程  虹1  刘彦仿1   张惠中2   沈万安2 

1中国人民解放军第四军医大学基础部病理学教研室  陕西省西安市  710033
2中国人民解放军第四军医大学唐都医院骨科  陕西省西安市  710038
项目负责人  程虹中国人民解放军第四军医大学基础部病理学教研室  陕西省西安市  710033
收稿日期  2000-02-22  接收日期  2000-04-18 


Subject headings  liver neoplasms; retroviridae; gene transfer; gene therapy; cloning, molecula;  single-chain bifunctional antibody; packaging cell line

主题词  肝肿瘤; 逆转录病毒科；基因转移；基因疗法；克隆，分子；单链双功能抗体;包装细胞


程虹,刘彦仿,张惠中,沈万安. 抗肝癌单链双功能抗体基因逆转录病毒表达载体的构建及病毒包装细胞系的建立.
世界华人消化杂志，2000；8(6)：708-709   


人类基因治疗技术的迅速发展使越来越多针对先天性和获得性疾病的基因治疗方案进入临床试验，同时，逆转录病毒作为介导基因转染的载体也是目前基础和临床应用研究中最广泛使用的基因转移方法［1-3］. 迄今所掌握的研究资料表明，接受逆转录病毒介导基因治疗的患者中尚未发现因病毒感染导致的不良反应. 因此，我们选择改造的缺陷型逆转录病毒载体pLXSN，将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因（sFv-TNF-α）克隆至该载体，进行病毒包装并筛选具有高滴度感染性重组病毒产生细胞系的研究.

1  材料和方法

1.1  材料  重组质粒pEGFP-sFv-TNF-α由本室构建. 逆转录病毒表达载体pLXSN、大肠杆菌HB101由廖文俊博士惠赠. 小鼠成纤维细胞PA317及NIH Swiss小鼠成纤维细胞NIH3T3购自中国科学院细胞库. 磷酸钙转染试剂盒和DNA纯化试剂盒购自Promega公司. 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DMEM，G418购自Gibco公司. PCR引物由上海生物工程公司合成.

1.2  方法

1.2.1  抗肝癌单链双功能抗体逆转录病毒表达载体的构建  制备平-粘末端的线性化pLXSN载体xhoⅠ单酶切载体pLXSN，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，重悬于Nuclease-Free 水中. Klenow大片段酶补平粘末端，37℃ 2h，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，溶于Nuclease-Free 水中. EcoRⅠ单酶切补平的线性化pLXSN载体，低熔点琼脂糖凝胶回收载体片段，WizardTM Minicolumn纯化. sacⅡ单酶切重组质粒pEGFP-sFv-TNF-α, Klenow大片段酶补平粘末端, EcoRⅠ单酶切补平的线性化质粒pEGFP-sFv-TNF-α，低熔点琼脂糖凝胶回收1260bp的sFv-TNF-α基因片段， WizardTM Minicolumn纯化. 将上述纯化的sFv-TNF-α片段与线性化pLXSN载体片段平-粘端连接, 其产物为pLXSN-sFv-TNF-α（简称PST）. 反应体系为: 线性化pLXSN载体片段1μL, sFv-TNF-α片段6μL, 10×连接缓冲液1μL, T 4DNA连接酶1μL, Nuclease-Free水补足10μL,16℃连接反应过夜. 制备HB101感受态宿主菌，冰浴条件下加入上述连接产物，冰浴30min， 42℃热休克90s后，迅速冰浴2min，加LB培养液800μL,37℃保温1h，涂于氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃培养过夜. 随机挑取上述连接产物转化的单个菌落，扩大培养，碱裂解法小量快速提取载体DNA，用3对引物分别扩增重组pLXSN-sFv-TNF-α载体中的Neo，sFv及TNF-α基因片段. PCR反应经30个循环，PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外透射仪上观察结果.

1.2.2  逆转录病毒产生细胞系的建立  以标准的磷酸钙共沉淀法将20μg重组质粒PST转染PA317包装细胞16h，换完全DMEM培养液继续培养36h，换以含600mg/L G418的完全DMEM培养液. 每4d换液1次，直至抗性细胞集落形成，挑选细胞集落，用普通完全DMEM培养液扩大培养，以制备含病毒的包装细胞上清并测定病毒滴度. 转染的包装细胞命名为PA317/PST. 病毒滴度测定以NIH3T3细胞为指示靶细胞. 将6×105  PA317/PST细胞接种于90mm培养皿中，细胞生长至80％以上汇合时换完全DMEM培养液，置37℃, 50mL/L CO2孵箱培养24h，1200×g离心10min收集细胞培养上清液. 接种于90mm培养皿中的2×105个NIH3T3细胞培养1d后，吸去培养液，加入1mL倍比稀释的PA317/PST细胞上清液(10，10-1，10-3/L), 置37℃, 50mL/L CO2孵箱培养5h，补加5mL完全DMEM培养液继续培养24h，换以含有500mg/L G418的完全DMEM培养液培养7d～14d，直至细胞集落形成，计数并计算集落形成率（colony forming unit,cfu）. 挑选出cfu最高的细胞集落，扩大培养. 分别提取逆转录病毒产生细胞PA317/PST、逆转录病毒转导细胞NIH3T3/PST及对照PA317, NIH3T3细胞中的基因组DNA. 取1×106细胞重悬于37.5μL溶液A（10mmol/L Tris-HCl pH 8.3，100mmol/L KCl ），加37.5μL溶液B（10mmol/L Tris-HCl pH 8.3，10g/L Tween 20，10g/L Nonidet P-40）及1μL蛋白酶K（20g/L），58℃水浴1h，98℃30min,12000×g离心1min，保留上清. 用Neo基因PCR引物分别扩增细胞基因组DNA中neo基因,以证实外源neo基因导入靶细胞.

2  结果

2.1  重组质粒PST中neo, sFv及TNF-α基因PCR鉴定  PCR产物于15g/L琼脂糖凝胶电泳，在327，470及790bp区域见强荧光条带分别与neo, TNF-α及sFv基因大小相符，阴性对照未见任何扩增条带.

2.2  逆转录病毒产生细胞系的建立及鉴定  20μg PST质粒经磷酸钙共沉淀法转染6×105 PA317包装细胞, 600mg/L G418筛选10d后挑选50个细胞集落，于不含G418的完全DMEM培养液中扩大培养，其中29个细胞集落存活，生长至2wk左右测cfu. 用倍比稀释的PA317/PST细胞上清感染NIH3T3细胞，24h后500mg/L G418筛选，10d～14d后镜下可见抗性细胞集落形成，结晶紫染色，计算cfu，筛选出具有最高cfu（1.6×109/L）的细胞集落C22. 对其细胞基因组DNA中Neo基因PCR分析结果显示，PA317/PST细胞和NIH3T3/PST细胞均扩增出327bp的条带，而对照PA317和NIH3T3细胞均未扩增出相应的条带.


3  讨论

将目的基因导入靶细胞是基因治疗过程中的一个重要环节， 其效率的高低将直接影响基因治疗的效果甚至成败. 而逆转录病毒介导的基因转移中高滴度感染性逆转录病毒包装细胞系的获得对目的基因转导效率至关重要. 我们所采用的逆转录病毒载体［4-6］pLXSN来源于Moloney小鼠白血病病毒(MoMuLV)，转染包装细胞后能够瞬时或稳定表达包装信号Ψ，插入的目的基因及标志基因neo，包装的子代病毒颗粒以芽生的方式从包装细胞膜分泌至培养上清，具有感染性但无复制能力，即建立了产生重组逆转录病毒颗粒的细胞系. 由于逆转录病毒包膜中含有env基因编码的一种糖蛋白，而许多哺乳动物细胞具有识别这种糖蛋白的受体，两者结合可介导逆转录病毒对靶细胞的有效感染，进而整合到宿主细胞染色体DNA中. PA317细胞是目前较广泛使用的第2代包装细胞［7］，能产生宽宿主谱的双向性毒种，而不产生可测出的辅助病毒，用它制备的逆转录病毒可以感染人和其他哺乳动物细胞，是一种广泛使用、较安全的包装细胞.
      本结果显示，在建立稳定并高效产生重组逆转录病毒的包装细胞系时，挑选细胞集落的数量不应少于50个，因为是否能高效、稳定包装子代逆转录病毒颗粒并不只取决于包装细胞中是否已导入逆转录病毒载体. 通过物理和化学方法介导的基因转移往往很难达到持续稳定的表达，外源基因只是随机整合到转染细胞的基因组DNA中，常常经受正常机制的降解并从细胞中排除出去，因而外源目的基因很容易丢失. 研究表明，PA317细胞转染后筛选出的病毒滴度大于1×106的细胞株只占很小的比例，都在5%以下［8］，因此，要筛选出一株较高滴度的重组逆转录病毒产生细胞，需要挑选足够数量的细胞集落. 在本实验中，我们将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因克隆至逆转录病毒表达载体pLXSN，包装后筛选出一株cfu＞1×109/L 的感染性重组病毒产生细胞系C22. 对C22细胞及其上清转导的NIH3T3细胞基因组DNA进行neo基因PCR分析，结果表明外源基因已整合到转染细胞DNA中，证实了重组病毒的活性及其转导靶细胞的可行性，为我们进一步应用抗肝癌单链双功能抗体基因进行肝癌基因治疗研究奠定了理论基础. 在以后的实验中，我们将用C22细胞产生的重组病毒上清感染人T淋巴细胞，观察转导T细胞对肝癌细胞的体外杀伤作用.


4  参考文献

1  Modesti N, Garcia J, Debouck C, Peterlin M, Gaynor R. Trans-dominant Tat mutants with  alterations in the basic domain inhibit
    HIV-1 gene expression. New Biol, 1991;3:759-768
2  Buchschacher GL Jr, Freed EO, Panganiban AT. Cells induced to express a  human immunodeficiency virus type 1 envelope
    gene mutant inhibit the spread of wild type virus. Hum Gene Ther, 1992;3:391-397
3  Duan L, Bagasra O, Laughlin MA, Oakes JW, Pomerantz RJ. Potent inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by
    an intracellular anti-Rev single-chain antibody. Proc Natl Acad Sci USA, 1994;91:5075-5079
4  Vile RG, Russell SJ. Retroviruses as vectors. Br Med Bull, 1995;51:12-30
5  Morgan EM. Cell line issues related to specific expression vectors: retrovirus vectors. Dev Biol Stand, 1992;76:301-305
6  Roemer K, Friedmann T. Concepts and strategies for human gene therapy. Eur J Biochem, 1992;208:211-215
7  Rigg RJ, Chen J, Dando JS, Forestell SP, Plavec I, Bohnlein E. A novel human amphotropic packaging cell line: high
    complement resistance, and improved safety. Virology, 1996;218:290-295
8  胡亮, 钱关祥, 沈文红，许伟榕，张腾飞，陈诗书. PA317产生高滴度带有人TNF-α基因逆转录病毒的研究.
    中国肿瘤生物治疗杂志, 1995;2:235-238