100023 北京市2345信箱 世界华人消化杂志  2000年1月15日;8(1):56-58
Email: wcjd@public.bta.net.cn 世界华人消化杂志  ISSN 1009-3079  CN  14-1260/R
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⊙研究原著⊙

树突状细胞诱导的抗肿瘤免疫诱导移植瘤细胞凋亡并抑制其增殖

李明松  袁爱力  张万岱  陈学清  谭晓华  朴英杰

中国人民解放军第一军医大学南方医院消化科   广东省广州市   510515
李明松，男，1966-12-16生，湖北省黄陂县人，汉族. 1988年第三军医大学本科毕业，1993年第三军医大学硕士研究生毕业，1996年第一军医大学博士研究生毕业，讲师、主治医生，主要从事消化道肿瘤免疫治疗的基础及临床研究，发表相关论文20篇.
项目负责人   李明松，510515，广东省广州市白云区同和，第一军医大学南方医院消化科.
Correspondence to Ming-Song Li, Department of Gastroenterology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515,Guangdong Province, China
收稿日期   1999-07-11   接收日期   1999-11-13


Immune response induced by dendritic cells induce apoptosis and inhibit proliferation of tumor cells

Ming-Song Li, Ai-Li Yuan, Wan-Dai Zhang, Xue-Qing Chen,  Xiao-Hua Tian and Ying-Jie Piao

Department of Gastroenterology, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China


Abstract

AIM   To study if the immune response in vivo induced by dendritic cells (DC) pulsed with tumor extract can inhibit the growth of implanted tumor in nude rats.

METHODS   DC isolated and purified was from hepatocellular cancer (HCC) patients with combination of granulocyte/macrophage colony stimulating factor and interleukin 4;  tumor associated antigen (TAA) extracted from HCC cell line HepG2 tumor cells; T lymphocyte initiated with DC pulsed by the TAA to cytotoxic T lymphocyte (CTL); CTL implanted to inhibit the growth of implanted tumor in rats; and the apoptosis and proliferation of tumor cells were evaluated.

RESULTS   CTL induced by DC pulsed with TAA can inhibit the growth of implanted tumor in rats by inducing apoptosis and inhibiting proliferation of tumor cells.

CONCLUSION   DC pulsed by TAA may play an important role in the treatment of tumors.

Subject headings   dendritic cells; carcinoma, hepatocellular; apoptosis; cell proliferation; liver neoplasms

Li MS, Yuan AL, Zhang WD, Chen XQ, Tian XH, Piao YJ. Immune response induced by dendritic cells induce apoptosis and inhibit proliferation of tumor cells.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,2000;8(1):56-58


摘要

目的  研究树突状细胞(DC)体外诱导的细胞免疫能否抑制裸鼠移植瘤生长及其机制.

方法  联合应用粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及白介素-4(IL-4)直接从肝癌患者外周血中培养出DC，以源于人肝癌细胞系HepG2肿瘤细胞的肿瘤抗原粗提物刺激DC，DC激活同源的T淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，建立裸鼠人肝癌细胞系HepG2移植瘤模型. 以CTL治疗裸鼠HepG2移植瘤并观察治疗效果，检测移植瘤标本肿瘤细胞凋亡情况.

结果  DC诱导的CTL通过诱导肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖而抑制移植瘤生长.

结论  经肿瘤抗原激发的DC有可能在肿瘤的治疗中发挥重要作用.

主题词 树突状细胞；肝肿瘤；细胞凋亡；细胞增殖；癌；肝细胞

李明松, 袁爱力, 张万岱, 陈学清, 谭晓华, 朴英杰. 树突状细胞诱导的抗肿瘤免疫诱导移植瘤细胞凋亡并抑制其增殖.
世界华人消化杂志， 2000;8(1):56-58


0   引言

宿主对肿瘤的排斥依赖于高效而特异的抗肿瘤细胞免疫. 树突状细胞(DC)在启动高效而特异的抗肿瘤细胞免疫反应中起关键作用［1］. 近期实验表明经GM-CSF及IL-4联合刺激及人肝癌细胞系HepG2细胞肿瘤相关抗原(TAA)激活后，肝癌患者DC能够诱导同源的T淋巴细胞增殖分化为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，该CTL在体外对HepG2细胞有高效而特异的杀伤作用［2］. 本实验将研究DC体外诱导的CTL在裸鼠体内的抗肿瘤作用及其机制.

1   材料和方法

1.1   材料   病理确诊的Child C级肝癌患者9例，均未接受任何抗肿瘤治疗. 4周龄BALB/c裸鼠20只，其中♂及♀各10只(购自上海动物研究所). 人肝癌细胞系HepG2细胞(购自中山医科大学病理研究所). GM-CSF，IL-4及IL-2均为Dako公司产品. bio-dUPT及dNPT为BM公司产品. Klenow大片段为Promega公司产品. 辣根过氧化酶标记生物素及抗增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体均为ZYMED laboratories. Inc.公司产品. ABC试剂盒为Vector公司产品. 透射电子显微镜(JEM－1200EX JOEN). SPF级动物实验室.

1.2   方法

1.2.1   自肝癌患者外周静脉血(10mL)中分离单个核细胞(PBMC)及T淋巴细胞［2］.

1.2.2   常规培养人肝癌细胞系HepG2细胞，收集HepG2细胞并超声粉碎，收集肿瘤细胞碎片作为TAA［2］.

1.2.3   TAA(1×106 HepG2细胞)刺激PBMC中DC［2］.

1.2.4   GM-CSF(200U/mL)及IL-4(1000U/mL)联合刺激PBMC中DC［2，3］.

1.2.5   DC诱导自体混合T淋巴细胞增殖分化为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)：于多孔板中加入TAA特异性DC(5×103)及与DC同源的T淋巴细胞(1×105)，置37℃，5% CO2中培养3d. 收集培养后T淋巴细胞，RPMI-1640稀释备用［2，3］.

1.2.6   CTL抑制裸鼠人肝癌细胞系HepG2移植瘤生长：于20只裸鼠一侧背部皮下接种HepG2细胞(1×106). 接种后16d于其中10只裸鼠另一侧背部皮下注射CTL(1×107)作治疗，另10只注射生理盐水作对照. 接种后22d作同样治疗1次. 接种后d37结束实验. 移植瘤大小记录为体积(mm3)=2-1×长×宽2［3］.

1.2.7   病理学检查   常规HE染色检测移植瘤标本肿瘤细胞凋亡；3＇-N末端原位标记检测移植瘤标本肿瘤细胞凋亡；透射电子显微镜观察移植瘤标本凋亡肿瘤细胞超微结构. 以HE染色为参考，细胞凋亡率表达为高倍视野每100个细胞中凋亡细胞数［4］. 抗PCNA单克隆抗体为一抗，移植瘤标本作ABC法染色. 阳性结果为细胞核呈棕褐色. 阳性率表达为高倍视野每100个细胞中阳性细胞数.

     统计学处理   所有变量均以x±s表达，以t检验分析两变量间差异性.

2   结果

2.1   接种后的d37，对照组及治疗组肿瘤大小分别为(547±32)mm3和(295±9.0)mm3 (P＜0.01).

2.2   CTL治疗后，HepG2移植瘤细胞出现广泛的凋亡(35%±3.6%)，与对照组(3%±2%)比较差异有非常显著意义(P＜0.01)(见图1，2).

2.3   经DC诱导的CTL治疗后，HepG2移植瘤细胞PCNA表达率(12%±5.8%)明显低于对照组(83%±6.1%，P＜0.01)(见图3).

2.4   凋亡肿瘤细胞超微结构见图4.

图1A   对照组，HepG2细胞少见凋亡，HE染色.×400

图1B   治疗组，HepG2细胞广泛凋亡，HE染色. ×400

图2A   对照组，HepG2细胞广泛凋亡，3＇-N末端原位标记，×400，核深染呈棕褐色者为凋亡细胞.

图2B   治疗组HepG2细胞广泛凋亡，3＇-N末端原位标记，×400，核深染呈棕褐色者为凋亡细胞.

图3A   对照组，胞核呈棕色者为生长良好HepG2细胞，ABC法，×400

图3B   治疗组，胞核呈棕色者为生长良好HepG2细胞，ABC法，×400

图4A   凋亡初期，胞核明显边集，透射电子显微镜. ×4000

图4B   凋亡中期，胞核裂解，透射电子显微镜. ×4000

图4C   肿瘤细胞凋亡形成凋亡小体，透射电子显微镜.×10000


3   讨论

实验结果表明，经GM-CSF及IL-4联合刺激并经HepG2细胞TAA激活后，肝癌患者外周血DC在体外启动的CTL通过诱导HepG2移植瘤细胞凋亡及抑制细胞增殖抑制HepG2移植瘤生长.
      恶性肿瘤的特点之一是肿瘤细胞的无限增殖性，表现为大量肿瘤细胞处于增殖周期的活跃期. PCNA为一种在增殖期肿瘤细胞中表达的多肽，肿瘤细胞增殖越活跃，PCNA表达水平越高. 因此，PCNA表达水平反应肿瘤细胞的增殖能力. 本实验显示DC诱导的CTL通过抑制肿瘤细胞增殖而抑制裸鼠HepG2移植瘤生长，但其确切的机制尚不清楚. 推测DC诱导的CTL及其分泌的细胞因子可能作用于肿瘤细胞，调节肿瘤细胞的某些基因产物(如编码周期素依赖性激酶(CDK)、周期素(cyclin)及CDK抑制剂(CDKI)基因的表达，从而抑制肿瘤细胞增殖. 有关DC诱导的CTL诱导肿瘤细胞凋亡的确切机制尚不清楚，推测可能与CTL及其分泌的细胞因子作用于肿瘤细胞而启动凋亡程序相关.
      DC不仅是职业抗原递呈细胞，更是一种天然的免疫佐剂，具有重要的免疫调节功能［1，5］. 因此经肿瘤特异性抗原激活的DC实质是一新型的抗肿瘤疫苗. 利用DC独特的免疫学功能有可能制备出具临床实用价值的抗肿瘤疫苗［5］.


4   参考文献

1 Engleman EG. Dendritic cells: potential role in cancer therapy. Cytotechnology,1997;25:1-8
2 Li MS, Yuan AL, Zhang WD, Liu SD, Peng QR, Zhang YL. Dendritic cells from hepatocellur carcinoma patients induce efficient
   and specific anti-tumor immune response.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 1999;7:161-163
3 Li MS, Yuan AL, Tan XH, Zhuang YA. Immune response induced by dendritic cells pulsed with tumor extracts in vivo inhibit growth
   of implanted tumor in nudes by inducing apoptosis of tumor cells. Zhongguo Zhongliu Linchuang, 1999;6:222-224
4 Ansari B, Coates PJ, Greenstein BD.In situ end labeling detect DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and
   pathological states. J Pathol,1993;170:1-4
5 Banchereau J, Steinman RM.Dendritic cells and the control of immunity. Nature, 1998;392:245-252