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100023 北京市2345信箱	世界华人消化杂志 2000年3月15日;8(3):289-291
Email: wcjd@public.bta.net.cn	世界华人消化杂志 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R
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⊙研究原著⊙

不同载体及靶基因对乙型肝炎病毒ＤＮＡ疫苗免疫效果的影响

王全楚周永兴姚志强冯志华

中国人民解放军第四军医大学唐都医院传染病科陕西省西安市 710038
王全楚，男，1966-12-11生，湖北省云梦县人，汉族，1990年第一军医大学本科毕业，1997年第四军医大学硕士研究生，主治医师，主要从事肝病的基础及临床研究，已发表论文30篇.
国家自然科学基金资助项目，No.39770665
项目负责人王全楚，710038，陕西省西安市新寺路1号，中国人民解放军第四军医大学唐都医院传染病科.
Supported by the National Natural Science Foundation of China, No.39770665
Correspondence to Quan-Chu Wang, Department of Infectious Diseases, Tangdu Hospital, the Fourth Military
Medical University, 1 Xinsilu, Xi＇an 710038, Shaanxi Province, China
Tel. 0086-29-3577595
Email. didthx@fmmu.edu.cn
收稿日期 1999-12-22 接收日期 2000-01-13

Effects of DNA vector constructs and different genes on the induction of immune
responses by HBV DNA-based vaccine

Quan-Chu Wang, Yong-Xing Zhou, Zhi-Qiang Yao and Zhi-Hua Feng

Department of Infectious Diseases, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi＇an 710038, Shaanxi Province, China

Abstract

AIM To study the effects of DNA vector constructs and different target genes on the efficiency of induction of immune responses to the HBV surface antigen (HBsAg) and HBV core antigen (HBcAg) in mice by DNA immunization.

METHODS The HBV surface gene and HBV C gene were cloned into two eukaryotic expression vector (pCR3.1 and pcDNA3). The Balb/c mice were immunized through multiple sites intramuscular injection with pCR3.1-S, pcDNA3-S or pCR3.1-C. Each mouse was boosted 2 weeks after immunization. The anti-HBs and anti-HBc antibodies were detected by ELISA, meanwhile, the stimulatory index of splenocytes on HBsAg or HBcAg was measured by MTT method.

RESULTS The titer of special antibody and the stimulatory index of splenocytes from mice coimmunized with pCR3.1-S, pcDNA3-S or pcR3.1-C were significantly higher than that of control. SI of immunized mice injected with pCR3.1-C was higher than that of pCR3.1-S group.

CONCLUSION Immunization of C gene and S gene of HBV could produce different cellular immune response of immunized mice, but different vector constructs with the same CMV promotor induced nearly the same immune response in mice.

Subject headings hepatitis B virus; gene immunization; humoral immunization; cellular immunization; hepatitis B vaccince

Wang QC, Zhou YX, Yao ZQ, Feng ZH. Effects of DNA vector constructs and different genes on the induction of immune responses by HBV DNAbased vaccine.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 2000;8(3):289-291

摘要

目的探讨不同DNA载体及靶基因对DNA疫苗免疫效果的影响.

方法用已构建的不同载体HBVS基因疫苗(pCR3.1 S,pcDNA3 S)和HBVC基因疫苗(pCR3 1 C)分别给Balb/c小鼠多点肌肉注射,2wk后追加免疫一次,用ELISA法及MTT法分别检测小鼠血清抗-HBs及抗HBc及脾细胞对HBsAg或HBcAg的特异性增殖反应.

结果免疫接种2wk后小鼠血清抗-HBs及抗HBc抗体均明显高于对照组,载体pCR3.1的表达效力稍高于pcDNA3,但同一基因不同载体间无显著差异.不同靶基因血清抗体滴度及脾细胞对HBsAg或HBcAg的刺激指数均明显高于对照组,刺激指数pCR3.1 C组明显高于单纯pCR3.1 S注射组.

结论两种载体均可以诱导较强的体液免疫应答;但同一基因不同载体间无显著差异.HBVS和C基因疫苗均可诱导较强的体液和细胞免疫应答强度;C基因以细胞免疫增高为主.

王全楚, 周永兴, 姚志强, 冯志华. 不同载体及靶基因对乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫效果的影响.世界华人消化杂志， 2000;8(3):289-291

主题词 乙型肝炎病毒；基因免疫；乙型肝炎疫苗；细胞免疫；体液免疫

0 引言

基因免疫是近几年发展起来的新的生物技术，不仅可诱导体液免疫应答，而且可诱导强烈而持久的细胞免疫应答^［¹^］. 然而，要使DNA疫苗从动物实验转为临床使用，尚有许多工作要作. 这是因为：①对DNA疫苗的免疫机制还远未了解；②DNA疫苗的效率有待加强；③DNA疫苗的安全性(主要涉及载体结构)尚待进一步确定. 为探求DNA载体对DNA疫苗免疫效果的影响，我们构建了乙型肝炎S基因和C基因的不同表达载体，并对不同载体免疫小鼠后的体液免疫应答进行了研究. DNA免疫虽然与传统的免疫手段存在明显的差异，但它们却有一个共同的特点，受到同一问题的困扰，即基因组中最有效免疫原部位的选择及其优化组合，这是DNA免疫诱导免疫应答强弱的关键. 如何使机体的免疫应答朝着有利于诱导CTLs免疫应答的方向发展，同时增强体液免疫应答的强度，尤其是对Th1/Th2平衡的影响备受关注^［²^］. 为探求乙型肝炎基因免疫的增强策略，我们对乙型肝炎病毒不同靶位点S基因和C基因免疫小鼠诱导的细胞和体液免疫应答进行了研究.

1 材料和方法

1.1 材料重组质粒的构建和大量制备：含乙型肝炎病毒S基因的质粒pCR3.1-S由姚志强教授在比利时鲁汶大学构建：以计算机设计PCR引物，从HBV患者血清(adw型)中获得HBV S基因序列，以T-A克隆法插入真核表达载体pCR3.1 (Invitrogen公司产品)，酶切、电泳，鉴定正向插入片段，最后得到重组质粒pCR3.1-S. 用限制性内切酶HindⅢ-XholⅠ双切pCR3.1-S，卸下630bp的S片段，glassmilk回收后，装入pcDNA3载体多克隆位点HindⅢ-XholⅠ之间，重新T4连接酶连接，得到重组质粒pcDNA3-S. 含乙型肝炎病毒C基因的质粒pCR3.1-C用基因克隆方法构建：从p1.2Ⅱ质粒卸下BamHⅠ-XholⅠ 1950bp的C基因，装入空载体pCR3.1的大片段BamHⅠ-XholⅠ之间，T4 DNA连接酶连接，转化，筛选，得到重组质粒pCR3.1-C. 以4种质粒(pCR3.1-S，pcDNA3-S，pCR3.1-C及空载体pcDNA3)分别转化感受态大肠杆菌JM109(本室保存)，筛选阳性克隆，经LB培养基扩增，按碱裂解法提取质粒，聚乙二醇(PEG)法纯化，通过紫外分光光度计测定其质量浓度，按1g/L溶于无菌生理盐水中，-20℃储存备用.

1.2 方法 基因免疫选用6wk～8wk龄♀ Balb/c小鼠(本校实验动物中心提供)，随机分为四组，分别注射pCR3.1-S，pcDNA3-S，pCR3.1-C各100μg/次. 对照组注射空载体pcDNA3 100μg/次，每组小鼠5只. 注射前以2.5g/L盐酸布比卡因100μg预处理小鼠股四头肌，24h后将相应质粒直接多点注射处理后肌肉，间隔2wk后追加免疫1次. 不同时间间隔剪尾取血.

1.2.1 抗-HBs和抗-HBc抗体检测 在HBsAg或HBcAg包被好的96孔ELISA软板(华美生物技术公司)中加入生理盐水稀释过的小鼠血清
(1∶50)，37℃孵育1h，洗涤后加入HRP标记羊抗鼠IgG，洗涤，加TMB为底物，于波长450nm处测ELISA OD值(ELISA仪系Bio-Rad公司产品)，以检测OD值/阴性对照A值≥2.1为阳性.

1.2.2 T细胞抗原特异性增殖反应测定 免疫4wk后，处死小鼠，取小鼠脾细胞，洗涤后用含100mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液重悬，制成细胞悬液浓度为1×109/L，加入96孔板，每孔100μg，平行3孔，分别加入HBsAg和HBcAg 5μg/孔. 37℃，50mL/L CO₂温育72h，加入四甲基偶氮唑盐(MTT) 10μg，37℃继续孵育4h，弃去孔内培养液，每孔加入DMSO 150μL，振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶免疫检测仪上测各孔OD490值，计算刺激指数(stimulatory index)，SI=实验孔OD值/对照孔OD值.

2 结果

重组质粒pCR3.1-C和pcDNA3-S的鉴定以HindⅢ-XholⅠ双切，分别卸下1063bp的C片段和630bp的S片段，
结果符合酶切图谱.

2.1 T细胞抗原特异性增殖反应 表1.

表1 不同组别小鼠脾细胞对HBsAg或HBcAg增殖反应的刺激指数(n=5)

组别	HBsAg	HBcAg
pCR3.1-S	1.685^a	1.203
pCR3.1-C	1.138	1.935^ac
pcDNA3	0.916	0.708

^aP＜0.05 vs 对照，cP＜0.05 vs pCR3.1-S组.

2.2 小鼠血清抗-HBs IgG和抗-HBc IgG检测 2wk后4个实验组均产生了抗-HBs或抗-HBc特异性抗体. 实验组效价明显高于对照组(P＜0.05，图1，免疫4wk后).

图1 抗-HBs或抗-HBc特异性抗体.

3 讨论

乙肝病毒引起的急慢性病毒性肝炎危害巨大，而且与肝纤维化和肝细胞癌的发生发展有着密切的关系. 基因疫苗技术的出现，不仅可以开发更有效的预防手段，达到最终控制病毒性肝炎的目的，而且开发能够用于病毒性肝炎的治疗性基因疫苗，造福于大量的病毒性肝炎的现症患者. 我们选用商品化的真核表达载体pcDNA3和pCR3.1(使用共同的CMV启动子CMV IE Pro/En)，能在多种细胞内高效表达，免疫小鼠后产生较高的抗体滴度. 插入的HCV基因片段去除了5＇，3＇端非表达序列，在CMV直接启动子的驱动下转录，有利于基因的表达.
影响DNA免疫效果的因素包括调控元件，免疫途径以及细胞因子等^［³^］. 其中，启动子的强弱直接影响质粒DNA在机体内表达外源蛋白水平，因而是DNA免疫应答的主要影响因素. 巨细胞病毒(CMV)早期即刻启动子的转录活性是较强的，其他类型的启动子的转录活性则相对较低. 本文同一基因不同载体诱导免疫应答的效果无明显差异，可能与使用的启动子相同有关，具体机制尚需进一步研究. HBV的DNA免疫不仅可以诱发针对HBsAg或HBcAg的体液反应，而且可诱导机体产生特异性CTL为标志的细胞免疫应答，并且持续较长时间. Michel et al^［⁴^］发现，注射DNA后1wk～2wk首先出现IgM，再经过1wk～2wk出现IgM到IgG的转换，并有辅助性T淋巴细胞反应. Guidotti et al^［⁵^］将HBsAg特异性CTL过继免疫给转基因小鼠导致HBV从肝脏中清除，可能与IFN的有效分泌从而增强机体对病原体的杀伤及清除作用有关. 我们的实验结果表明，编码HBV S基因和C基因的表达质粒可以诱导小鼠产生较强的体液和细胞免疫，尤以后者为甚. pCR3.1-C诱导产生的体液免疫稍低于pCR3.1-S，但产生的T细胞增殖反应和抗原特异性细胞毒活性明显增强. 如何选择最有效的免疫原部位并加以优化组合，使基因免疫早日过渡到慢性乙型肝炎患者的临床治疗，将是今后努力的一个方向.

4 参考文献

1 Schirmbeck R, B hm W, Ando K, Chisari FV, Reimann J. Nucleic acid vaccination primes hepatitis B virus surface antigen
    specific cytotoxic T lymphocytes in nonresponder mice. J Virol, 1995;69:5929-5934
2 Chow YH, Chiang BL, Lee YL. Development of Th1 and Th2 populations and the nature of immune response to hepatitis B virus
    DNA vaccine can be modulated by codelivery of various cytokine genes. J Immunol, 1998;160:1320-1329
3 Li WB, Yao ZQ, Zhou YX, Feng ZH. Studies on immunization with HBV gene vaccine plus HBsAg protein in mice.
    Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 1999;7:188-190
4 Michel ML, Davis HL, Schleef M, Mancini M, Tiollais P, Whalen RG. DNAmediated immunization to the hepatitis B surface antigen
    in mice: aspects of the humoral response mimic hepatitis B viral infection in humans. Proc Natl Acad Sci USA, 1995;92:5307-5311
5 Guidotti LG, Ando K, Hobbs MV. Ctotoxic T lymphocytes inhibit hepatitis B virus gene expression by a noncytolytic mechanism
    in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA, 1994;91:3764-3768