| 100023 北京市2345信箱 | 世界华人消化杂志 2000年3月15日;8(3):285-288 |
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⊙研究原著⊙
胃癌及癌前病变组织中ＭＵＣ２基因的表达
汪荣泉 房殿春 刘为纹
中国人民解放军第三军医大学西南医院消化科
重庆市 400038
汪荣泉，男，1968-07-14生，浙江省常山县人，汉族.
1992年第三军医大学本科毕业，1996年第三军医大学西南医院消化科硕士，1999年博士、讲师，主治医师.
主要从事肝癌与胃癌的发生机制研究，发表论文30篇.
本课题由全军“九五”医药卫生科研基金资助，No.96M091
项目负责人 汪荣泉，400038，重庆市，中国人民解放军第三军医大学西南医院消化科.
Supported by Key Project Fund for Army Medical and Health 9th 5-Year Plan
Correspondence to Rong-Quan Wang, Department of Gastroenterology,
Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038,China
Email. rongquanw@hotmail.com
Tel.
0086-23-65314116
MUC2 gene expression in gastric cancer and
preneoplastic lesion tissues
Rong-Quan Wang, Dian-Chun Fang and Wei-Wen Liu
Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical College, Chongqing 400038, China
Abstract
AIM To elucidate the expression of MUC2 gene in the normal gastrointestinal mucosa, preneoplastic lesion and
gastric cancer and its clinicopathological significance.
METHODS MUC2
apomucin was detected by immunohistochemistry, MUC2 mRNA was detected by in
situ
hybridization.
RESULTS MUC2
apomucin and MUC2 mRNA were mainly located in the duodenal glandulae and not in the gastric mucosa. The
detective rates in the intestinal metaplasia (IM, n=27) and gastric cancer
(n=46) were 85%, 32% and 67%, 58% respectively. MUC2 apomucin expression in IM
was not associated with different
degrees of IM (P＞0.05).
No relationship was found between MUC2 gene expression in cancerous tissues with
invasiveness, metastases of lymph node,
clinical stages and different types of gastric cancer (P＞0.05). Tumor
differentiation in the positive group of MUC2 apomucin was significantly
different from the negative group (P＜0.05).
CONCLUSION MUC2
gene expression is markedly increased in gastric cancer and preneoplastic lesion, and MUC2 apomucin
expression in the gastric cancer is associated with tumor differentiation.
Subject headings MUC2 gene; apomucin; stomach neoplasms; gene expression
Wang RQ, Fang DC, Liu WW. MUC2 gene expression in
gastric cancer and preneoplastic lesion tissues.
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 2000;8(3):285-288
摘要
目的
揭示MUC2基因在正常胃肠道粘膜、癌前病变和胃癌组织中的表达规律及其临床病理意义.
方法
应用免疫组织化学SP法检测组织中MUC2核粘蛋白的表达,应用原位杂交方法检测组织中MUC2mRNA的表达.
结果
MUC2核粘蛋白及其mRNA主要在十二指肠内表达,正常胃粘膜内不表达;肠上皮化生(n=27)和胃癌组织(n=46)的表达率分别为85%,32%和67%,58%;肠化内MUC2基因表达与肠化分型之间无关(P>0.05);胃癌组织中MUC2基因表达与肿瘤浸润、淋巴结转移、临床分期和胃癌的分型之间无关(P>0.05),而MUC2核粘蛋白阳性组与阴性组之间的肿瘤分化存在明显的差别(P<0.05).
结论 MUC2基因在胃粘膜的癌变过程中是明显上调表达的,胃癌内MUC2核粘蛋白的表达与胃癌的分化有关.
主题词 MUC2基因;核粘蛋白;胃肿瘤;基因表达;癌前状态
汪荣泉,房殿春,刘为纹.胃癌及癌前病变组织中MUC2基因的表达.世界华人消化杂志，2000;8(3):285-288
0 引言
粘蛋白在人胃肠道、呼吸道和生殖道中起重要的保护和润滑作用，粘蛋白分子本身又是高分子质量、高度糖化的分子，由蛋白骨架和O-糖苷键糖链组成.
在粘蛋白核心骨架基因克隆之前，对粘蛋白的认识局限在占80%重量的碳水化合物分子上.
炎性疾病和肿瘤的发生发展过程中粘蛋白的碳水化合物成分发生了质和量的改变［1，2］.
近年至少7种不同的粘蛋白核心骨架的cDNA从人胃肠道、气管支气管粘膜表达文库中克隆成功，这对其表达的异质性、多态性和功能的理解具有重要的意义. MUC2基因是从小肠粘膜的cDNA表达文库中所克隆［3］，定位于11p15.
我们应用MUC2核粘蛋白的单抗和合成的寡聚核苷酸探针检测人正常胃肠粘膜、肠上皮化生和胃癌组织中MUC2基因的表达规律，进而揭示其可能预示的临床病理意义.
1 材料和方法
1.1
材料 正常胃粘膜10例取自胃癌手术切缘组织，经HE染色不存在癌组织及癌前病变，十二指肠组织2例取自胃癌切除标本的十二指肠部分；胃窦和胃底组织1例取自胃溃疡患者胃切除标本.
胃癌组织46例取自本院手术切除标本，其中37例含癌旁胃粘膜，27例具肠化.
所有标本均经10mL/L福尔马林固定，石蜡包埋，5μm连续切片，HE染色，病理确诊.
胃癌患者男34例，女12例，年龄32岁～72岁，平均54.6岁. 胃癌患者的分期以TNM国际分期法进行，癌组织大小、淋巴结转移、浸润深度以术中所见，病理检查以术前的辅助检查为准. 胃癌的分型和肠化的分型利用AB/PAS染色和HID/AB染色方法，具体参见文献［4］.
抗MUC2核心肽的单克隆抗体CCP58购自深圳晶美公司(Neomarker公司)，针对MUC2基因的寡聚核苷酸探针序列为：5＇-GGTCTGTGTGCCGGTGGGT-GTTGGGGTTGGGGTCACCGTGGTGGTGGT-3＇，由上海市中科院细胞所合成. SP试剂盒，去离子甲酰胺购自北京中山公司. DAB显色试剂盒、多聚赖氨酸购自福州迈新公司，核-4乳胶购自中国原子能研究所. DEPC，蛋白酶K，鲑精DNA，DTT，Ficoll400，硫酸葡聚糖购自Sigma公司，［γ-32P］ATP购自北京亚辉公司，SG-50购自Pharmacia公司.
1.2 方法
1.2.1 免疫组化染色
切片常规脱蜡、水化后，用内源性过氧化物酶阻断剂和正常非免疫马血清分别室温孵育30min以减低非特异性染色；抗核心肽的单抗(1∶100) 4℃孵育过夜；生物素标记的二抗和抗生物素-过氧化物酶连接物分别孵育30min；显色1min～3min，苏木素衬染、脱水、透明、封片. 实验中设立空白试验和替代试验作为阴性对照，以确保实验的特异和可靠性.
1.2.2 原位杂交
MUC2探针42pmol(3μL)中加T4多聚核苷酸激酶2μL，去离子水25μL，缓冲液5μL和15μL的370GBq/L［γ-32P］ATP,37℃水浴中置4h，0.5mol/L的EDTA终止反应，自制SG-50柱层析分离. 切片脱蜡、水化后，经0.1mol/L PBS，0.1mol/L甘氨酸/PBS和TritonX-100/PBS漂洗后，2mg/L蛋白酶K 37℃消化30min，40mL/L多聚甲醛后固定5min，0.1mol/L
PBS，2.5g/L 乙酸酐和2×SSC分别漂洗后预杂交30min(37℃)，杂交37℃过夜，每张切片加10μL～20μL标记探针，杂交液由0.5kg/L甲酰胺，100g/L硫酸葡聚糖，1×Denhardt液，0.25g/L 变性鲑精DNA，10mmol/L DTT等组成，经梯度SSC，0.05mol/L
PBS漂洗后，梯度酒精脱水、干燥，在暗室中浸融化的核-4乳胶，干燥后，暗盒内放射自显影7d，D-19b液显影、定影，甲基绿衬染，脱水、透明、封片. 实验中采用不加同位素标记的探针和杂交前用RNA酶处理切片作为阴性对照.
统计学处理
数据经χ2
检验，P＜0.05为相差显著，P＜0.01为相差非常显著.
2 结果
正常胃粘膜中无MUC2核粘蛋白及其mRNA的表达，这包括胃窦和胃底组织；而十二指肠、空肠的杯状细胞中存在MUC2核粘蛋白及其mRNA，其蛋白定位于杯状细胞的核周和核上，也在粘液滴周有少量的存在，而粘液滴内阴性，阳性染色似一戒指，并以核周明显.
MUC2 mRNA的杂交信号(放射自显影的银染颗粒)全部位于杯状细胞内，其中有的杯状细胞可见中空的阴性反应区域，有的几呈一个中间密度略低的黑色影，所有的杯状细胞，反应强度高低不等，接近粘膜表面的杯状细胞多为阴性(图1).
2.1 肠上皮化生粘膜中MUC2核粘蛋白及其mRNA的表达
肠上皮化生粘膜中MUC2核粘蛋白及其mRNA的阳性表达率分别是85%(23/27)和32%(6/19). MUC2核粘蛋白在肠化组织中的表达呈不均一性，大多数的杯状细胞核周有阳性染色，少数杯状细胞阴性(图2)，除一例杯状细胞的粘液滴内出现阳性表达外，其余均为阴性. 2例具肠化的癌旁粘膜中腺颈部细胞出现灶状的表达，而阳性细胞不具备杯状细胞的特征(粘液滴)(图3).
MUC2 mRNA在肠化组织中表达阳性率为32%(6/19)，阳性者中部分肠化组织可为阴性，阳性的肠化组织中MUC2
mRNA的杂交信号位于杯状细胞的粘液滴周(图4). 不同程度肠化标本中MUC2核粘蛋白的表达无差异(P＞0.05).
2.2 胃癌组织中的MUC2基因的表达
胃癌组织中MUC2核粘蛋白及其mRNA的阳性表达率分别为67%(31/46)，58%(22/38). MUC2核粘蛋白位于阳性癌细胞的胞质内，以核周明显，呈细颗粒状，不同患者的MUC2核粘蛋白表达强度有差别(图5). MUC2 mRNA阳性胃癌细胞的分布呈散在、灶状和弥漫分布(图6). 胃癌组织中MUC2核粘蛋白的表达与患者肿瘤浸润深度、淋巴结转移、临床分期和胃癌的分型之间无关(P＞0.05)，而MUC2核粘蛋白的阳性组与阴性组之间的肿瘤分化类型(低分化和高-中分化)存在明显的差异(P＜0.05，表1).
表1 胃癌组织核粘蛋白表达与临床病理的联系
| 因素 | n | MUC2(+) | MUC2(-) | |
| 淋巴结转移 | 有 | 23 | 18 | 5 |
| 无 | 23 | 13 | 10 | |
| 低a | 17 | 8 | 9 | |
| 分化类型 | 高-中 | 26 | 21 | 5 |
| 印戒 | 3 | 2 | 1 | |
| 浆膜 | 26 | 18 | 8 | |
| 浸润 | 无 | 20 | 13 | 7 |
| 分期 | Ⅰ～Ⅱ | 26 | 16 | 10 |
| Ⅲ～Ⅳ | 20 | 15 | 5 | |
| 病理 | 肠型 | 21 | 15 | 6 |
| 胃型 | 17 | 11 | 6 | |
| 混合型 | 8 | 5 | 3 |
aP＜0.05，vs
高-中.
图1 十二指肠腺内MUC2
mRNA的表达.
甲基绿衬染×100
图2 肠上皮化生粘膜内MUC2核粘蛋白的表达.
苏木素衬染×200
图3 无肠上皮化生胃粘膜腺颈细胞内MUC2核粘蛋白的表达.
苏木素衬染×200
图4 肠化粘膜内MUC2
mRNA的表达.
甲基绿衬染×400
图5 胃癌组织内MUC2核粘蛋白的表达.
苏木素衬染×100
图6 胃癌组织内MUC2
mRNA的表达.
甲基绿衬染×200
3 讨论
MUC2基因与其他粘蛋白基因一样，由可变数目的重复序列组成，其VNTR序列为PTTTPISTTTTV-TPTPTPTGTQT2. 人上皮细胞的恶性转化往往涉及粘蛋白的结构和合成的改变，我们研究MUC2核心骨架蛋白基因表达的改变，MUC2基因在胃粘膜不表达，仅在肠道粘膜的杯状细胞内表达. 肠化和胃癌组织中MUC2核粘蛋白及其mRNA的表达阳性率分别是85%，32%和67%，58%. 这种事实提示，MUC2基因在胃癌前病变和胃癌的发生发展过程中是明显上调表达，即涉及MUC2基因的激活. 我们的结果与Ho et al［5］的结论相比，检出率较高，但分布特点与Ho et al和Carrato et
al［6］的结果相似.
有意义的是我们发现2例具有肠化改变的胃粘膜中无肠化生的区域(未出现杯状细胞)的腺颈部细胞胞质内出现强阳性的MUC2核粘蛋白的表达，这种现象提示肠化形成之前，腺颈部部分细胞就出现了结构和功能的改变—MUC2基因激活，这是否提示MUC2核粘蛋白可用作肠化形成前的标志，需进一步的研究证实.
MUC2基因的表达出现人胃粘膜癌变过程中，胃癌组织中MUC2核粘蛋白的表达与患者的肿瘤浸润深度、胃癌分型、临床分期和淋巴结转移无关，而高-