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100023 北京市2345信箱	世界华人消化杂志 2000年2月15日;8(2):128-130
Email: wcjd@public.bta.net.cn	世界华人消化杂志 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R
http:// www.wjgnet.com	版权归世界胃肠病学杂志社

⊙研究原著⊙

IL-12及HBV基因疫苗共同免疫小鼠的效果

杜德伟周永兴冯志华姚志强李光玉

中国人民解放军第四军医大学唐都医院感染病防治中心 陕西省西安市 710038
杜德伟，男，1966-08-30生，吉林省德惠市人，汉族. 1989年第四军医大学医疗系毕业，第四军医大学唐都医院感染病防治中心1998级硕士研究生，主治医师，讲师.
国家自然科学基金资助项目，No.39770665
项目负责人杜德伟，710038，陕西省西安市，中国人民解放军第四军医大学唐都医院感染病防治中心.
Supported by National Natural Science Foundation of China, No. 39770665
Correspondence to De-Wei Du, Prevention and Treatment Center of Infectious Diseases, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi＇an 710038, Shaanxi Province, China
Tel. +86-29-3577595Email. didthx@fmmu.edu.cn
收稿日期 1999-12-22 接收日期 2000-01-10

Immune responses to interleukin 12 and hepatitis B gene vaccine in H-2^d mice

De-Wei Du, Yong-Xing Zhou, Zhi-Hua Feng, Zhi-Qiang Yao and Guang-Yu Li

Prevention and Treatment Center of Infectious Diseases, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, 
Xi＇an 710038, Shaanxi Province, China

Abstract

AIM To observe the immune responses to gene vaccines coding HBV surface antigen and interleukin 12 in Balb/c (H-2^d) mice.

METHODS The immunization was performed by intramuscular injection in the experiment. Anti-HBs in serum was detected by ELISA. The activity of HBsAg specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) was measured by 51chromiun release assay.

RESULTS Eight wk after immunization, the serum A (OD value) of mice codeliveried IL-12 vaccine (1.67±0.15) was significantly higher (P＜0.01) than that of mice intramuscularly injected HBV-S DNA vaccine (0.8±0.1) and these two values were significantly higher than that of mice injected pCR3.1 (P＜0.01). CTLs activities of mice codeliveried IL-12 vaccine and injected HBV-S DNA vaccine only were 73.3%±8.8% and 50.5%±6.4% respectively (P＜0.01). There were significant differences compared with that of injected pCR3.1 (P＜0.01). CTLs activities were 75.6%±9.1% and 48.3%±5.9% respectively after adding anti-CD4⁺monoclonal antibody in spleen cells, and were 16.3%±2.3% and 10.6%±1.4% respectively after adding anti-CD8⁺monoclonal antibody in spleen cells.

CONCLUSION The DNA vaccine of pCR3.1-S has strong antigenecity in cellular and humoral immunity which can be promoted by vector coding murine IL-12. CTLs activity is performed by CD8⁺cells. DNA vaccine against HBV may be useful for both prophylactic and therapeutic purposes.

Subject headings gene vaccine; mice; hepatitis B surface antigen; interleukin-12; eukaryotic expression plasmid

Du DW,Zhou YX,Feng ZH,Yao ZQ,Li GY.Immune responses to interleukin 12 and hepatitis B gene vaccine in H2 d mice.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,2000;8(2):128-130

摘要

目的观察编码鼠IL-12的真核表达载体对HBV DNA疫苗诱导Balb/c小鼠免疫应答的影响.

方法肌肉注射DNA疫苗，ELISA法检测小鼠血清抗HBs，4h⁵¹Cr释放法检测小鼠脾细胞CTL杀伤活性.

结果免疫8wk后，注射pCR3.1组、注射pCR3.1-S组及共注射IL-12真核表达载体的血清A(OD值)分别为0.04±0.01，0.87±0.1及1.67±0.15. CTL细胞杀伤活性分别为10.1%±6.4%，50.5％±6.4%及73.3%±8.8%，后两组与pCR3.1组比较均有显著差异(P＜0.01)，后两组比较均有显著差异(P＜0.01). 脾细胞悬液经抗CD4⁺单克隆抗体处理后分别为48.3%±5.9%，75.6%±9.1%，抗CD8⁺单克隆抗体处理后分别为10.6%±1.4%，16.9%±2.3%.

结论 IL-12的真核表达载体能够提高小鼠对DNA疫苗的免疫应答，CTL细胞杀伤活性主要由CD8⁺执行. 基因疫苗可能用于预防及治疗HBV感染.

主题词 基因疫苗；小鼠；乙型肝炎病毒表面抗原；白细胞介素-12；真核表达载体质粒

杜德伟,周永兴,冯志华,姚志强,李光玉.IL-12及HBV基因疫苗共同免疫小鼠的效果.世界华人消化杂志，2000;8(2):128-130

0 引言

病毒感染严重危害人类身体健康，清除病毒感染主要依靠细胞免疫或细胞因子的作用，细胞免疫通过特异性CTL识别，杀伤，破坏病毒感染的细胞，清除感染细胞内的病毒. 大量资料表明，慢性乙型肝炎及其病毒携带者细胞免疫功能明显低下^［¹^］. 基因疫苗(核酸疫苗、DNA疫苗)是指含有编码某种蛋白抗原基因的真核表达质粒，直接接种体内后，被体细胞摄取并表达相应抗原，进而激发出保护性免疫应答，包括特异性CTL应答及特异性抗体的产生^［²^］. IL-12是目前发现对体内免疫活性细胞诱导和调节作用最强、范围最广的细胞因子，在肿瘤、病毒性疾病及自身免疫性疾病的治疗中起主要作用. 我们将HBV DNA疫苗(pCR3.1-S)^［³^］与编码鼠IL-12的真核表达载体^［⁴^］(pWRG3169,下简称IL-12)共同免疫小鼠后，观察其对小鼠免疫应答的影响.

1 材料和方法

1.1 材料 ♀ 5～8周龄Balb/c小鼠购自本校实验动物中心；P815小鼠肥大细胞瘤细胞系，含有HBV S抗原的真核表达质粒pCR3.1-S及编码鼠IL-12 p35，p40的真核表达载体pWRG3169均由本室保存；脂质体(美国Gibco公司)、G418，RPMI-1640细胞培养基(美国Sigma公司)；小牛血清、抗HBs ELISA检测试剂盒、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG均购于华美西安公司；小鼠抗HBs，抗小鼠CD4⁺，CD8⁺单克隆抗体购于武汉博士德公司.

1.2 方法 ①质粒大量制备及纯化：用碱裂解法大量提取质粒，PEG(聚乙二醇)沉淀法纯化后用于转染P815细胞及免疫小鼠. ②质粒转染P815细胞及表达产物的检测：用脂质体转染技术将纯化后的pCR3.1-S质粒转染P815细胞，用含G418(350mg/L)筛选，当对照细胞大部分死亡后换含G418(150mg/L)的细胞培养基，大约2wk后，间接免疫荧光检测转染细胞内HBsAg的表达，全部阳性后，作为杀伤实验的靶细胞. ③质粒免疫：20只小鼠随机分为4组，每组5只，以5g/L布比卡因+10g/L对羟基苯甲酸甲酯处理小鼠股四肌肉，24h后同一部位注射质粒，一组注射100μg pCR3.1空载体；一组注射pCR3.1，pCR3.1-S各50μg；一组注射pCR3.1-S+，pWRG3169 IL-12各50μg，1次/2wk，连续8wk，一组仅注射pCR3.1，pCR3.1-S各50μg1次. ④血清抗HBs检测：注射前剪尾采用40μL加入生理盐水100μL稍离心取上清，-20℃保存，ELISA法检测试剂盒测抗HBs，操作按照说明书进行. ⑤存活小鼠特异性CTLs杀伤功能测：小鼠免疫8wk 后，引颈处死，无菌状态下取存活小鼠脾脏，研磨过滤网，制成单细胞悬液，用4h⁵¹Cr释放法测定CTLs杀伤效应. 效应细胞：靶细胞(E∶T)为及100∶1. 特异性CTLs杀伤(%)=(实验组cpm-自然释放cpm)/(最大释放cpm-自然释放cpm).

2 结果

2.1 IL-12的真核表达载体对HBV DNA疫苗诱导小鼠抗HBs的影响 一次免疫后抗HBs在6达到高峰，以后似有下降趋势，多次免疫抗HBs随免疫次数增加而增加. IL-12的真核表达载体可以提高基因疫苗诱导小鼠抗HBs的产生，在任何时间点联合免疫与单纯HBV基因疫苗相比都具有显著差异(图1).

2.2 小鼠脾细胞HBsAg特异性CTLs杀伤性 pCR3.1-S免疫小鼠产生了很强的CTLs杀伤活性，IL-12的真核表达载体可以明显提高小鼠脾细胞HBsAg特异性CTLs杀伤活性(P＜0.01)，与对照组相比亦有显著性差异(P＜0.01，图2).

图1 IL-12的真核表达载体对HBV基因疫苗诱导小鼠抗HBs的影响bP＜0.01vs pCR3.1；dP＜0.01vs pCR3.1-S

图2 IL-12真核表达载体对HBV基因疫苗诱导CTLs杀伤率的影响.bP＜0.01vs pCR3.1；dP＜0.01vs pCR3.1-S

3 讨论

基因疫苗以其制备、操作简便，可诱导体液和细胞免疫的优势成为抗病毒感染新型疫苗的研制热点. 已在许多方面显示出广泛的应用前景^［³^］. 1996年美国FDA批准对健康志愿者进行艾滋病DNA疫苗人体实验. 1998年MacGregor　et al^［⁵^］首次报道了基因疫苗治疗艾滋病病毒HIV-1感染者的人体实验结果. 尽管疫苗对许多病原体产生免疫应答，但不同的疫苗相差悬殊，有些疫苗甚至在大剂量长期使用仍很难诱发有效的免疫应答^［⁶^］. HBV基因组S区是唯一能够刺激机体产生保护性抗体的区域，同时HBsAg蛋白的28～39多肽还能诱导特异性TCL反应^［²^］. 这表明以S区基因刺激机体可能产生预防和治疗同一病毒感染的细胞免疫及体液免疫反应. Davis et al^［⁷^］用HBV DNA疫苗免疫HBsAg转基因小鼠，发现DNA疫苗可以使对HBsAg无应答的转基因小鼠产生免疫应答. 亦证实DNA疫苗不仅具有预防作用，同时具有治疗作用. Chow et al^［⁸^］发现注射编码不同的细胞因子的真核表达载体可以提高和调整机体对疫苗的免疫应答. IL-12是一种重要的抗病毒细胞因子，可以诱导内源性IFN-γ的产生，而IFN-r可促进IL-12的产生，形成二者的正反馈途径，共同调节细胞亚群分化，使CD4⁺向Th1分化，刺激细胞分化增殖，从而促进细胞免疫应答.
IL-12的真核表达载体主要起免疫佐剂作用，这种作用依赖于两种质粒的共注射，分别注射两种质粒对免疫应答无影响，说明细胞因子与抗原注射同一部位对细胞因子的佐剂作用至关重要^［⁸^］. 含有HBV基因S区的DNA疫苗与编码IL-12的真核表达载体共同免疫小鼠，结果显示IL-12真核表达载体可明显提高基因疫苗诱导的免疫应答. 联合免疫小鼠血清抗HBs在任何时间点均较单纯HBV基因疫苗免疫组明显增高. 体外杀伤实验证实，DNA疫苗明显提高小鼠脾细胞的CTL杀伤率，IL-12的真核表达载体可以明显提高DNA疫苗诱导的CTLs反应. 与对照组相比具有显著性差异. 用抗CD8⁺单克隆抗体处理效应细胞后CTLs的杀伤效应明显降低，而抗CD4⁺单克隆抗体对CTLs的杀伤效应无明显影响. 证明CTLs杀伤作用主要由CD8⁺T淋巴细胞完成. 与国外文献报道^［⁹^］一致. 但也有人报道^［¹⁰^］在原始的MLC中加入IL-12，CD8/CD4比率下降50%，并抑制继发的IFN-r产生，IL-12如何提高CTLs杀伤活性，尚待阐明.
HBV感染目前尚无理想的治疗措施，本研究证实了DNA疫苗的细胞及体液免疫原性以及细胞因子对其免疫应答的促进作用，为临床预防及治疗HBV感染提供了有效手段.

4 参考文献

1 Geissler M, Tokashige K, Wakita T, Zurawski VR Jr, Wands JR. Differential cellular and humoral immunization using chimeric
    constructs. Vaccine, 1998;16:857-867
2 Schirmbeck R, Bohm W, Ando K, Chsari FV, Reimann J.   Nucleic acid vaccination primes hepatitis B virus surface antigen
    -specific cytotoxic T lymphocytes in nonresponder mice. J Virol, 1995;69:5929-5934
3 Li WB, Yao ZQ, Zhou YX, Feng ZH. Study on immunization with HBV gene vaccine plus HBsAg protein in mice. 
    Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 1999;7:188-190
4 Rakhmilevich AL, Turner J, Ford MJ, McCabe D, Sun WH, Sondel PM, Grota K, Yang NS. Gene gun-mediated skin transfection
    with interleukin 12 gene results in regression of established primary andmetastatic murine turmors. 
    Proc Natl Acad Sci USA, 1996;93:6291-6295
5 MacGregor RR, Boyer JD, Ugen KE, Lacy KE, Gluckman SJ, Bagarzzi ML, Chattergoon MA, Baine Y, Higgins TJ, Ciccarelli RB,
    Conney LR, Ginsberg RS, Weiner DB. First human trial of a DNA-basedvaccine for treatment of human immunodeficiency
    virus type-1. infection: safety and host response. J Infect Dis, 1998;178:92-100
6 Robinson HL, Torres CAT. DNA vaccine. Semin Immunol, 1997;9:271-284
7 Davis HL, Brazolot Millan CL, Mancini M, McCluskie MJ, Hadchoue M, Comanita L, Tiollais P, Whalen RG, Michel ML.
    DNA-based immunization against hepatitis B surface antigen (HBsAg) in normal and HBsAg-transgentic mice. 
    Vaccine, 1997;16:849-852
8 Chow YH, Chiang BL, Lee YL, Chi WK, Lin WC, Chen YT, Tao MH. Development of Th1 and Th2 populations and the nature
    of immune responses to hepatitis B virus vaccine can be modulated by codelivery of various cytokine genes. 
    J Immunol,