| 100023 北京市2345信箱 | 世界华人消化杂志 1999年11月15日;7(11):955-957 |
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⊙研究原著⊙
基因疫苗诱导小鼠抗HBV皮下移植瘤免疫研究
杜德伟 周永兴 冯志华 李光玉 姚志强
中国人民解放军第四军医大学唐都医院感染病防治中心
陕西省西安市
710038
杜德伟，男，1966-08-30生，吉林省德惠市人，汉族.
1989年第四军医大学医疗系毕业，第四军医大学唐都医院感染病防治中心1998级硕士研究生，主治医师，讲师.
国家自然科学基金资助项目，No.39770665.
项目负责人 杜德伟，710038，陕西省西安市，中国人民解放军第四军医大学唐都医院感染病防治中心.
Supported by National Natural Science Foundation of China, No.39770665.
Correspondence to De-Wei Du, Prevention and Treatment Center of
Infectious Diseases, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi＇an 710038, Shaanxi Province, China
Tel. +86·29·3577595
Email. didthx@fmmu.edu.cn
收稿日期 1999-09-15
接收日期
1999-09-22
Study on immunization of anti subcutaneous transplanting tumor induced by
gene vaccine
De-Wei Du, Yong-Xing Zhou, Zhi-Hua Feng, Guang-Yu Li
and Zhi-Qiang Yao
Prevention and Treatment Center of Infectious Diseases, Tangdu Hospital, Fourth
Military Medical University, Xi＇an
710038, Shaanxi Province, China
Abstract
AIM To
observe the specific cellular immune responses and the protection against P815 mastocytoma cells stable
expressing HBV surface antigen (P815-HBV-S) in Balb/c (H-2d)
mice after DNA immunization of HBV surface antigen (pCR3.1-S).
METHODS The
immunization was performed by intramuscular injection in this experiment. Three weeks later, we directly
inoculated P815-HBV-S into mice by subcutaneous injection. The tumor growth was
measured every five days and HBsAg
specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) activity was measured by 51 Chromiun
release assay.
RESULTS HBV-S
DNA vaccine can evidently inhibit the tumor growth, prolong the survival period (＞38.2d)
and improve the survival rate (87.5%) in mice. Meanwhile, HBsAg specific CTLs activity
were obviously increased after DNA immunization (51% vs
21%, P＜0.001).
CONCLUSION The
RESULTS showed that the DNA vaccine of pCR3.1-S had strong antigenecity in cellular immunity and
had marked killing effect on HBV infected cells in vivo.
DNA vaccine against HBV may be useful for both prophylactic and therapeutic purposes.
Subject headings DNA vaccine; hepatitis B surface antigen; mice; gene therapy
Du DW, Zhou YX, Feng ZH, Li GY, Yao ZQ. Study on
immunization of anti subcutaneous transplanting tumor induced by gene
vaccine.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,1999;7(11):955-957
摘要
目的
观察HBVDNA疫苗(pCR3-1-S)诱导Balb/c小鼠(H-2d)的特异性细胞免疫应答及其对稳定表达HBsAg的小鼠肥大细胞瘤P815细胞(P815-HBV-S)(H-2d)成瘤性的影响.
方法
肌肉注射DNA疫苗,背部皮下接种P815-HBV-S细胞,观察成瘤情况,4h51Cr释放法检测小鼠脾细胞CTL活性.
结果
接种DNA疫苗后小鼠成瘤率为12.5%,对照组为100%.小鼠平均存活期大于38.2d,对照组为28.4d,40d后小鼠存活率为87.5%,对照组为0%.CTL细胞杀伤活性明显增加,pCR3-1-S组51%,对照组为21%(P<0-001).
结论 DNA疫苗可以诱导细胞免疫应答,对体内HBV感染具有预防及治疗作用.
主题词 DNA疫苗;肝炎病毒表面抗原;乙型;小鼠;基因治疗
杜德伟, 周永兴, 冯志华, 李光玉, 姚志强.基因疫苗诱导小鼠抗HBV皮下移植瘤免疫研究.世界华人消化杂志,1999;7(11):955-957
0 引言
基因DNA疫苗(核酸疫苗、DNA疫苗)是指含有编码某种蛋白抗原基因的真核表达质粒，直接接种体内后，可以被体细胞摄取并表达相应抗原，进而激发出保护性免疫应答，包括特异性CTL应答及特异性抗体的产生［1］. 前者主要通过特异性CTL识别、杀伤、破坏病毒感染的细胞，在清除感染细胞内的病毒过程中起重要作用. 后者主要中和血液中游离的病毒.
我们用HBV DNA疫苗免疫小鼠后，再用P815-HBV-S攻击小鼠，检测小鼠特异性CTL杀伤活性及观察DNA疫苗对P815-HBV-S成瘤作用的影响.
了解DNA疫苗对体内HBV感染的治疗作用.
1 材料和方法
1.1 材料 5～8周龄♀ Balb/c小鼠购自本校实验动物中心，P815小鼠肥大细胞瘤细胞系我校免疫教研室闵密克硕士惠赠，含有HBV-S抗原的真核表达质粒pCR3.1-S［2］由本室保存.
脂质体(美国Gibco公司)、G418、RPMI-1640细胞培养基(美国Sigma公司)、小牛血清、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG均购于华美西安公司，小鼠抗HBsAg单克隆抗体购于武汉博士德公司.
1.2 方法
①质粒大量制备及纯化：用碱裂解法大量提取质粒，PEG(聚乙二醇)沉淀法纯化后用于转染细胞及免疫动物. ②质粒转染P815细胞及表达产物的检测：用脂质体转染技术将纯化后的pCR3.1-S质粒转染P815细胞，用含G418(350mg/L)筛选，当对照细胞大部分死亡后换含G418(150mg/L)的细胞培养基，大约2wk后，间接免疫荧光检测转染细胞内HBsAg的表达，全部阳性后，作为杀伤实验的靶细胞及动物接种细胞. ③质粒免疫及细胞接种程序：18只小鼠随机分为2组，pCR3.1空载体组10只，pCR3.1-S组8只，以肌肉注射方式免疫，1次/wk，连续4wk.
两组分别注射100μg pCR3.1空载体和pCR3.1-S质粒，3wk后pCR3.1组又随机分为2组，1组与pCR3.1-S组一道按1×1010细胞/L于小鼠背部皮下接种P815-HBV-S细胞，观察肿瘤生成、生长及小鼠存活情况. 另1组作为测定CTLs杀伤效应的对照组. ④存活小鼠特异性CTLs杀伤功能测定：接种P815-HBV-S细胞后40d，无菌状态下取存活小鼠脾脏，制成单细胞悬液，用4h51Cr释放法测定CTLs杀伤效应.
效应细胞：靶细胞为25∶1，50∶1及100∶1. 特异性CTLs杀伤(%)=［(实验组cpm值-自然释放cpm值)/(最大释放cpm值-自然释放cpm值)］.
2 结果
2.1 DNA疫苗对P815-HBV-S细胞成瘤作用的影响小鼠经过pCR3.1空载体免疫后成瘤率为100%(5/5)，而pCR3.1-S免疫组仅12.5%(1/8)，两组比较具有显著差异(P＜0.05). pCR3.1-S免疫组小鼠平均寿命明显延长(表1)，存活率明显增加(图1)、肿瘤生长缓慢(图2). 两组肿瘤生长曲线回归后斜率做t检验，差异显著(P＜0.001).
2.2 小鼠脾细胞HBsAg特异性CTLs杀伤性
pCR3.1-S免疫小鼠产生了很强的CTLs杀伤活性，与对照组相比具有显著性差异(P＜0.001，表1).
图1 两组小鼠生存率的比较(P＜0.05).
图2 两组小鼠皮下移植瘤生长曲线(P＜0.001).
表1 两组小鼠存活期和特异性CTLs杀伤率的比较
| 分组 | n | 存活期 | 杀伤率%(效应细胞/靶细胞) | ||
| 25∶1 | 50∶1 | 100∶1 | |||
| pCR3.1组 | 5 | 28±5.2 | 8±1.1 | 11±2.1 | 21±3.0 |
| pCR3.1-S组 | 8 | ＞38±5.4a | 33±3.5b | 40±4.8b | 51±6.6b |
aP＜0.05，bP＜0.001，vs
pCR3.1组.
3 讨论
DNA疫苗是一种给予抗原的免疫手段，并以其制备、操作简便，可诱导体液和细胞免疫的优势成为抗病毒感染新型疫苗的研制热点. 已经在许多难治性感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病和肿瘤性疾病的预防及治疗领域显示出广泛的应用前景［3］.
1996年美国FDA已经批准对健康志愿者进行艾滋病DNA疫苗人体实验.
1998年MacGregor
et
al［4］首次报道了DNA疫苗治疗艾滋病病毒HIV-1感染者的人体实验结果.
在HBV基因组中S区是唯一能够刺激机体产生保护性抗体的区域，同时HBsAg蛋白的28～39多肽还能诱导特异性TCL反应［1］. 这表明以S区基因刺激机体可能产生预防和治疗同一病毒感染的细胞免疫及体液免疫反应. 因此，我们选择含有HBV
S区基因的DNA疫苗，观察细胞免疫应答及其抗肿瘤免疫. 有关HBV DNA疫苗诱导体液免疫的文献我室已有报道［2］.
CTL杀伤靶细胞需对表达抗原和主要组织相容性复合物的(MHC)的双重识别，目前缺乏合适的HBV感染的动物模型. 为了探讨DNA疫苗在体内的预防及治疗作用，我们用经pCR3.1-S质粒转染、G418筛选并稳定表达HBV S抗原的P815小鼠肥大细胞瘤细胞P815-HBV-S皮下接种BABL/c小鼠形成的皮下移植瘤作为HBV感染的动物模型，观察DNA疫苗对肿瘤形成的影响. 结果发现DNA疫苗可以明显降低肿瘤形成率，抑制肿瘤生长和延长小鼠的存活期. 说明DNA疫苗在体内的确有预防和治疗作用. Davis et
al［5］用HBV
DNA疫苗免疫HBsAg转基因小鼠，发现DNA疫苗可以使对HBsAg无应答的转基因小鼠产生免疫应答. 亦证实DNA疫苗不仅具有预防作用，同时具有治疗作用.
另外，体外杀伤实验证实，DNA疫苗可以明显提高小鼠脾细胞的HBsAg特异性CTL杀伤率(P＜0.001)，具有很强的细胞免疫原性，可以诱导宿主产生明显的CTLs反应.
我室冯志华博士［6］首次在国内应用抗CD8+及CD4+细胞单克隆抗体处理效应细胞后测定CTLs杀伤效应，结果显示抗CD8+抗体能够明显降低CTLs的杀伤效应，而抗CD4+抗体对CTLs的杀伤效应无明显影响. 证明CTLs杀伤作用主要由CD8+ T淋巴细胞完成.
与国外文献报道一致［7］.
HBV感染目前尚无理想的治疗措施，DNA疫苗的优点就在于既可以诱导体液免疫又能诱导细胞免疫，本研究证实了DNA疫苗具有很强的细胞免疫原性并对体内病毒感染具有预防及治疗作用，可能成为预防及治疗HBV感染的新的有效手段.