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100023 北京市2345信箱	世界华人消化杂志 1999年10月15日;7(10):887-889
Email: wcjd@public.bta.net.cn	世界华人消化杂志 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R
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⊙文献综述⊙

胃癌基因治疗研究进展

余文林黄宗海

中国人民解放军第一军医大学附属珠江医院普外科广东省广州市 510282
项目负责人 余文林中国人民解放军第一军医大学附属珠江医院普外科广东省广州市 510282
收稿日期 1999-05-25

Subject headings stomach neoplasms/therapy; gene therapy

主题词 胃肿瘤/治疗；基因治疗

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，占我国恶性肿瘤发病率和死亡率的首位，全世界每年约有68万新确诊病例. 尽管通过手术治疗、放疗和化疗等可取得一定的疗效，但对于多数中、晚期患者，其效果仍不能令人满意. 近年来许多学者进行了胃癌基因治疗的新探索，试图从分子水平寻找一种更有效的辅助疗法. 现就胃癌基因治疗研究进展综述如下.

1 自杀基因治疗

自杀基因治疗是众多基因治疗策略中效果最明显、最有前途的策略之一. 该疗法又称为病毒导向的酶解前药疗法或分子化疗. 其原理是将一些病毒或细菌基因组中前药转换酶基因(也叫自杀基因)导入肿瘤细胞，该基因编码特殊的酶，可将原先对哺乳动物细胞无毒性的前药在肿瘤细胞中代谢为毒性产物，从而引起这些细胞自杀. 目前用于治疗胃癌的自杀基因方案主要有以下几种：单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus-thymidine kinase, HSV-TK)基因/丙氧鸟苷(GCV,gancyclovir)系统、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶(varicella-zoster virus-thymidine kinase, VZV-TK)基因/6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖核苷(AraM)系统、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(Escherichia coli cytosine deaminase, Ec-CD)基因/5-氟胞嘧啶(5-FC)系统、大肠杆菌尿嘧啶磷酸核糖转移酶(Escherichia coli uracil phosphoribosyltransferase)基因/5-氟尿嘧啶(5-FU)系统.
TK酶能选择性地使抗病毒药物GCV磷酸化成为单磷酸化产物，并在细胞内磷酸激酶作用下，形成三磷酸产物，干扰、阻断DNA的正常合成和细胞增殖. Yoshida et al^［¹^］用逆转录病毒携带HSV-TK基因经脂质体包裹后转导人胃癌细胞株TMK-1，给不同浓度(0.1mg/L～100mg/L)的GCV治疗，转基因癌细胞(TMK-TK)均有死亡，并呈现时间剂量依赖关系. 将1×106个TMK-TK细胞接种到Balb/c裸小鼠皮下，2wk后腹腔注射GCV(20mg/kg·d×14d)，结果实验组中13只动物有12只瘤体直径由治疗前平均6.5mm减少到小于1mm，取得了满意的疗效. Tanaka et al^［^2，3^］将癌胚抗原(CEA)启动子与TK基因相接，构建特异性嵌合基因pCEA/TK，用腺病毒载体将其导入CEA分泌型胃癌细胞株MKN28及MKN45和CEA非分泌型细胞MKN1，发现GCV对前两种细胞的半数抑瘤浓度(IC50)分别为21mg及5.8mg，并发现有明显的旁观者效应(bystander effect)，而对MKN1的IC50则大于300mg. 随后将2×106个MKN45细胞接种到裸鼠皮下，d3瘤体直径达3mm～4mm，将腺病毒载体直接注入瘤体，经GCV作用后，发现TK基因选择性表达于30%左右CEA阳性癌细胞，瘤体生长明显受抑. Lan et al^［^4，5^］运用同样的策略观察CD基因的治疗作用，体内外实验均取得较好的效果. 这一新的治疗方法给临床根治胃癌尤其是中晚期胃癌带来了很大的希望.
自杀基因疗法具有安全、高效、特异和应用范围广的特点，人们已设计出应用HSV-TK基因疗法或CD基因疗法治疗肿瘤的多种成熟的治疗方案，美国已开展CD基因治疗大肠癌的临床试治研究，确切疗效还有待于长期观察. 相信随着特异性载体的进一步发展和完善，自杀基因疗法会成为具有广泛应用性和有效性的基因治疗工具.

2 抑癌基因治疗

研究表明，胃癌的发生是一个多基因多步骤综合作用的结果，与多个癌基因的激活、扩增及抑癌基因的失活有关. 当抑癌基因突变、缺失等原因而失活时，细胞易在其他因素的作用下发生癌变. p53基因为一种抑癌基因，作为一种细胞增殖的负性调节因子调控细胞的生长和分化，维持基因组DNA的稳定. 野生型P53蛋白能诱导P21蛋白表达，该蛋白能与细胞周期依赖性激酶(CDKs)结合，阻止细胞通过细胞周期进行有丝分裂，使细胞停止在G₁期，从而使细胞的生长和增殖受到抑制^［⁶^］. 有实验表明，p53基因在胃癌中突变率最高，其失活可能在胃癌的发生发展中起着重要的作用. 因此，将野生型p53基因(WTp53)转染肿瘤细胞可能是抑制肿瘤生长的有效方法. Matozaki et al^［⁷^］构建了人野生型p53基因重组表达载体，经脂质体包裹将其导入胃癌细胞株MKN，结果转基因细胞(MKN/p53细胞)较之亲本细胞和转入空白载体的细胞明显减少，其³H-TdR掺入率也明显降低. MTT法发现转基因的细胞生长速度明显减慢，流式细胞仪测定G₀/G₁期细胞数明显升高，而S期细胞下降. 但将p53基因导入无p53基因突变的胃癌细胞系，则对其无影响，表明p53基因转导对有p53基因突变的胃癌有治疗作用. p16基因又称MTS1基因(multiple tumor suppressor 1)，野生型P16蛋白通过抑制CDK4及CDK6而直接抑制细胞周期. 该基因较小，编码含148个氨基酸的蛋白质，因此用p16基因做靶分子进行基因操作比p53容易得多. P16在多种肿瘤细胞系及肿瘤组织中均有高频率纯合性缺失及点突变，总突变率达70%左右. 孙梅et al^［⁸^］构建mts1/p16基因的表达载体并导入表达水平下调的PAMC 82胃癌细胞，PCR及Northern结果发现转染p16基因的PAMC82细胞(命名为PAMCp16)有外源性mts1/p16基因的整合及表达，在裸鼠中的致瘤性显著降低. 肿瘤组织病理分析结果显示PAMCp16细胞形成的肿瘤，其分化程度优于亲本细胞，说明导入外源性mts1/p16基因可抑制肿瘤细胞的恶性增殖和促进细胞分化. GC因子(GCF)可通过与表皮生长因子受体(EGFR)基因启动子上特异的GC富含区结合，抑制了它的转录，并降低了其他生长因子如α-转化生长因子(TGF-α)、胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)和C-met的mRNA的表达. 有人用GCF基因转染人胃癌细胞株TMK(TMK/GCF)后接种于裸鼠皮下，肿瘤生长速度比对照组明显减慢. 这说明GCF基因作为一种负性调节因子能通过对EGFR和其他生长因子基因的调控来抑制胃癌细胞的生长. Hung et al^［⁹^］用阳离子脂质体或腺病毒载体将5型腺病毒E1a基因或SV40大T抗原基因导入荷瘤小鼠体内的肿瘤细胞，发现两种载体的转导率较高，并且转基因细胞的生长明显受抑制，荷瘤动物存活期明显延长.

3 反义基因治疗

肿瘤的反义基因治疗就是应用反义核酸在转录和翻译水平阻断某些异常基因的表达，以期阻断瘤细胞内的异常信号传导，使瘤细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋亡，或抑制自分泌生长因子的分泌，封闭其受体以改变肿瘤的生物学特性达到治疗肿瘤哪康 Bcl基因为一种凋亡抑制基因，通过影响细胞内Ca²⁺通道以及IL-2β转换酶(ICE)的表达和释放而抑制细胞凋亡，并与Bax,TNF,Fas的结合与调节有关. 它虽不促进细胞增殖，但可明显延长细胞的存活时间，在胃癌中常过度表达. 肖冰et al^［¹⁰^］采用分子克隆技术构建了反义核酸表达载体pDOR-Bcl-2-cDNA，以脂质体转染受体细胞SGC7901，获得Bcl-2表达阻断的胃癌细胞株(7901anBcl-2细胞)，结果表明转导株和非转导株均有Bcl-2 cDNA的表达，但转导株Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平明显低于非转导株. 说明在胃癌细胞中Bcl-2基因处于高表达状态，反义Bcl-2可有效地阻断Bcl-2的表达. 增殖细胞核抗原(PCNA)是一种能通过δ-DNA聚合酶诱导DNA合成的核蛋白. 在胃癌细胞中其基因表达明显增高，并与胃癌的侵袭、转移有关. 因此利用反义技术合成PCNA的反义cDNA与其相互作用，以抑制或封闭其表达可能是一种有效的基因治疗策略. Sakakura et al^［¹¹^］构建了PCNA反义寡核苷酸的真核表达质粒，将其转染入7种不同的胃癌细胞株，发现转基因胃癌细胞与亲本细胞相比，其生长速度均有不同程度的减慢，软琼脂集落形成能力减弱，PCNA活性降低，并在10mmol/L～40mmol/L的浓度下具有剂量效应关系. 表明通过反义技术抑制PCNA基因的表达可抑制胃癌生长及逆转胃癌细胞的恶性表型，达到控制胃癌生长的目的. 李文梅et al^［¹²^］用基因重组技术将H-ras反义RNA重组至逆转录病毒载体PLXSN中，用之转染BGC823细胞，转基因细胞在裸鼠体内的致瘤性明显受到抑制.
从肿瘤的发病机制来看，反义基因治疗无疑是一种很有前途的治疗方法. 但目前仍存在一些问题：肿瘤是一种多基因遗传病，不同胃癌存在多种癌基因的激活，单一癌基因的反义阻断也不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长；目前反义核酸对靶基因的特异性并不强，很容易对靶细胞周围的细胞产生非特异性阻断；另外目前所用的反义表达载体及反义寡核苷酸都存在体内迅速失活的问题，特别是人工合成的寡聚药物. 这些问题限制了反义基因疗法向临床应用的过渡.

4 免疫基因治疗

基本思路是将免疫细胞因子基因或HLA基因导入肿瘤组织以增强肿瘤微环境及系统的抗瘤免疫，避免全身大剂量应用细胞因子产生的严重的毒副作用. 主要有两种方法：①细胞因子导入免疫效应细胞；②细胞因子导入肿瘤细胞. 将细胞因子基因导入肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)或肿瘤特异性杀伤细胞(如LAK，CTL，巨噬细胞等)，这些转基因免疫活性细胞被回输入荷瘤宿主后，就能选择性聚集在肿瘤组织中，产生细胞因子，提高局部细胞水平，并使转基因免疫活性细胞发挥较强的抗肿瘤效应. 从理论上讲该疗法是目前最为理想的一种过继性细胞免疫治疗方法. 但实践证明该方法治疗效果不尽人意，存在明显的局限性，主要表现在转基因免疫活性细胞体内靶向性差，存活时间短. 目前尚未见有该方法用于胃癌的基因治疗的报道.
     目前肿瘤细胞靶向的细胞因子基因治疗相当热门，该疗法以主动性免疫治疗为基础，即将细胞因子基因转染入肿瘤细胞中，制备出免疫原性更强的新型瘤苗，以激发机体产生显著的抗肿瘤免疫功能从而达到治疗肿瘤的目的. 目前用于胃癌基因治疗的细胞因子主要有TNF，IL-2，4，6，IFN-γ，GM-CSF等，均收到不同程度的治疗效果. 周志强et al^［¹³^］构建人IL-2及IL-4真核表达载体，转染人胃癌细胞株SGC-7901，发现转基因细胞表达有活性的IL-2及IL-4，基因转导不改变胃癌细胞的体外生长特性，并能增强LAK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，降低或消除胃癌细胞的体内致瘤性，并且发现转基因细胞经大剂量射线照后，仍可以持续分泌IL-4，3wk～4wk. 证明该种瘤苗的安全性. Matsubara et al^［¹⁴^］用逆转录病毒分别将IL-2，IL-4及GM-CSF基因导入胃癌细胞后，观察射线对这些细胞代谢及细胞因子分泌的影响，所有细胞在接受6Gy照射后细胞代谢部分抑制，剂量为20Gy时完全抑制细胞代谢，而细胞因子的分泌则不受影响，即使在60Gy照射后仍可检测到有细胞因子分泌，这些特性对于设计新型瘤苗将是非常有益的.
    免疫基因治疗虽然取得了一定的成效，但许多报道表明细胞因子基因治疗效果不甚明显. 由于机体的免疫反应是有众多细胞及因子参与，经过多种信号识别、传导的复杂应答过程，目前尚难以找到一种或几种细胞因子基因以全面调动免疫系统并彻底清除肿瘤；其次细胞因子存在双重性问题，即有些细胞因子不但不能消除肿瘤，而且能促进肿瘤生长；另外部分细胞因子本身的作用机制尚远未清楚，故细胞因子基因治疗的实验研究尚有相当的任务要作.
     此外，肿瘤侵袭和转移的发生与肿瘤细胞产生多种蛋白水解酶降解细胞外基质和基底膜成分有关，晚近研究表明金属蛋白酶抑制剂TIMPs基因具有抑制肿瘤细胞表达Ⅳ型胶原酶的作用. 李楠et al^［¹⁵^］构建了含人全长TIMP-2 cDNA基因的可控逆转录病毒表达载体，导入高侵袭力的人胃癌细胞SGC-7901B，检测到TIMP-2基因整合到细胞基因组DNA中，并在mRNA和蛋白水平表达明显增高，Ⅳ型胶原酶表达受抑制，转基因细胞在裸鼠体内成瘤性及侵袭性均受到抑制，说明TIMP-2基因作用一个负性调控因子下调了胃癌细胞的恶性侵袭表型. Takehara et al^［¹⁶^］研究了成年鼠胃粘膜下注射裸DNA进行基因转染的可行性，结果在粘膜肌层及肌层的平滑肌细胞、固有层的间质细胞中检测到报告基因的表达，证明胃粘膜下直接注射裸DNA进行基因转染的可行性. 另外通过内镜进行胃癌原位基因转染亦有报道，该方案更适合临床实际要求，具有开发和广泛应用的价值.
      基因治疗是近年来发展起来的一种肿瘤治疗方法，有许多技术问题仍待进一步解决. 胃癌的基因治疗起步较晚，实验多停留在细胞和动物水平，离临床应用仍然存在较大距离. 但随着分子生物学技术的不断发展和肿瘤生物学研究的深入，相信基因治疗方案将更完善，成为临床治疗胃癌的一种重要辅助手段.

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