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100023 北京市2345信箱	世界华人消化杂志 1999年4月15日;7(4):280-284
Email: wcjd@public.bta.net.cn	世界华人消化杂志 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R
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⊙研究原著⊙

河南食管癌高发区居民多灶性食管癌前病变
和癌组织p53基因的突变分析

邹建湘¹ 王立东¹ Shi ST Yang GY² Xue ZH² 高珊珊¹ 李永欣¹ Yang CS²

¹河南医科大学癌症研究室河南省郑州市 450052
²Laboratory for Cancer Research, College of Pharmacy, Rutgers University, Piscataway, NJ 08854 USA
*国家自然科学基金课题，No.39840012和39670296. 美国NCI，CA65871和国家人事部重点资助优秀留学回国人员课题.
项目负责人 王立东，450052，河南省郑州市，河南医科大学癌症研究室.
*Supported by the National Natural Science Foundation of China, No.39840012, 39670296 and fund from NCI of USA, CA65781.
Correspondence to Li-Dong Wang, Laboratory for Cancer Research, Henan Medical University,
Zhengzhou 450052, Henan Province, China
Tel. +86·371·6970165
收稿日期 1998-08-17

p53 gene mutations in multifocal esophageal precancerous and cancer ous lesions in patients with esophageal cancer in high-risk northern China

jian-Xiang Zou¹, Li-Dong Wang¹, Shi Stephanie T.² Guang-Yu Yang²,
Zhi-Hong Xue², Shan-Shan Gao¹, Yong-Xin Li¹ and Yang Chung S²

¹Laboratory for Cancer Research, Henan Medical University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
²Laboratory for Cancer Research, College of Pharmacy, Rutgers University, Piscataway, NJ 08854, USA

Abstract

AIM To characterize P53 gene mutations in multifocal esophageal precancerous and cancerous lesions from the same patients to further understand its role in esophageal carcinogenesis.

METHODS With immunohistochemistry, immunohisto-selective sequencing and PCR-SSCP-DNA sequencing methods, p53 protein accumulation and P53 gene mutation were determined on 43 surgically-resected human esophageal specimens, which contain squamous cell carcinoma and precancerous lesions in different parts from a high-incidence area, Linzhou, Henan. For all the precancerous lesions and some of the tumor sections with low percentage of P53 immunostain-positive cells (＜30%), UV irradiation was used to enrich the P53 immunostain-positive cells in the DNA preparation.

RESULTS P53 gene mutations were detected in 30 out of 43 (70%) SCC cases. Among 29 SCC cases that were stained positive for P53 protein, 25 (86%) were found to contain P53 mutations. In P53 immunostain-positive precancerous lesions adjacent to cancer, P53 mutations were detected in 7 of 16 (47%) basal cell hyperplasia (BCH), 8 of 12 (67%) dysplasia (DYS) and 6 of 7 (86%) carcinoma in situ (CIS). All mutations found in lesions with DYS and CIS were the same as those in the nearby SCC, although in 2 cases the mutations were only detected in SCC but not the nearby lesions with DYS. In 7 cases of BCH containing mutations, only 3 had the same mutations as the nearby SCC, and the other 4 had mutations different from the nearby SCC.

CONCLUSION The P53 mutations in DYS and CIS are strongly associated with SCC. P53 mutations in BCH need to be further characterized to elucidate its biological consequence.

Subject headings esophageal neoplasms; precancerous condition; p53 gene; mutation

Zou JX, Wang LD, SHI Stephanie T, Yang GY, Xue ZH, Gao SS, Li YX, YANG Chung S. p53 gene mutations in multifocal esophageal precancerous and cancerous lesions in patients with esophageal cancer in high-risk northern China.
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,1999;7(4):280-284

摘要

目的探讨肿瘤抑制基因p53在同一患者多灶性食管癌前病变和癌组织中的突变特征,以加深对其在食管癌发生过程中作用的认识.

方法采用免疫组织化学、选择性免疫组化、DNA(PCR-SSCP-DNA)测序方法,对来自食管癌高发区林州市的43例食管癌手术切除标本的癌组织及癌旁非癌病变作P53蛋白表达及突变分析.癌前病变和p53表达较弱的癌组织(阳性细胞<30%),采用紫外线照射办法提高阳性细胞数再作DNA制备.

结果受检的43例鳞癌中,30例检出有p53基因突变(70%),其中29例P53蛋白表达阳性鳞癌中的25例检出有p53基因突变(86%).对癌旁P53蛋白表达阳性的癌前病变分析显示,16例基底细胞增生中的7例(47%),12例间变中的8例(67%),7例原位癌中的6例(86%)检出有p53基因突变.尽管有2例受检组织突变只见于癌组织,而其癌旁的间变组织未发现突变,但间变和原位癌中检出的p53基因突变与鳞癌中检出的p53基因突变类型相同.7例基底细胞增生组织中,只有3例检出的p53基因突变类型与其邻近的癌组织相同,其余4例突变类型不同于邻近的癌组织.

结论发生间变和原位癌组织的p53基因突变与食管鳞癌非常一致,而发生在基底细胞过度增生病变的p53基因突变的生物学意义尚有待进一步研究证实.

主题词 食管肿瘤;癌前状态;p53基因;突变

邹建湘, 王立东, Shi ST Yang GY, Xue ZH, 高珊珊, 李永欣, Yang CS.河南食管癌高发区居民多灶性食管癌前病变和癌组织p53基因的突变分析.世界华人消化杂志,1999;7(4):280-284

0 引言

食管上皮癌变是一个多阶段进行性过程，常经历正常上皮基底细胞增生间变原位癌，最后形成浸润性癌^［^1-4^］. 已往的研究显示，P53蛋白的累积和基因突变发生在食管癌变的极早期阶段，甚至轻度的基底细胞增生和形态学上接近正常的上皮也有这种改变^［^5-14^］. 对于无症状非癌患者食管不同部位发生的间变组织P53基因突变类型不同^［¹⁵^］. 最近，作者建立了一种免疫组化选择性筛选方法，以提高癌前病变组织中P53蛋白阳性表达细胞的突变分析的精确性^［¹⁶^］. 依此方法，作者分析了43例食管鳞状细胞癌手术切除标本原发灶及邻近的P53蛋白阳性染色的癌前病变组织中的p53基因的突变状况. 由于癌组织和癌前病变组织来自同一患者，从而提高了不同病变组织中p53基因突变状况的可比性，并对加深P53基因在食管癌变过程不同时期作用的了解具有重要意义.

1 材料和方法

1.1 材料人食管组织标本取自河南食管癌高发区患者，用850mL/L酒精固定. 组织经常规组织学处理和石蜡包埋，作HE 染色和P53免疫染色. 所有组织块均切成5μm厚的切片，并粘附至透明塑料片上(Xerox公司提供)，于60℃烘烤30min，再冷却至室温作免疫染色. 免疫组化采用ABC法^［¹⁶^］，ABC 试剂盒和DAB底物试剂盒购自 Vecter Laboratories, P53抗体，Ab-6由Oncogene Science提供，实验过程中使用试剂提供者建议的2倍镍量，以增强染色强度.

1.2 方法

1.2.1 组织的DNA制备 ①先将癌组织切片作P53免疫染色，再将阳性染色区域切下，以确保制备液中至少有80%的P53阳性染色细胞. 切下的组织小碎片置入Eppendorf管，用100μL～200μL消化缓冲液(10mmol/L Tris-HCl, 2mmol/L EDTA, pH 8.0, 0.4g/L蛋白酶K)消化，55℃孵育3h. ②癌前病变组织(包括基底细胞增生、间变和原位癌)和P53阳性染色细胞不足30%的肿瘤组织，均作紫外线照射，以提高阳性细胞数量. 详细操作方法见作者以往报道^［¹⁶^］. 此后，将含有P53阳性细胞的组织用无菌剪刀剪成碎片，置于Eppendrof管，用25μL～50μL消化缓冲液消化，55℃孵育3h.

1.2.2 P53基因PCR-SSCP-DNA测序 P53基因PCR扩增所用引物分别为：5’-ACT TCC TGA AAA CAA CGT TC-3’和5’-CAG GCA TTG AAG TCT CAT GG-3’用于第4外显子；5’-GTT TCT TTG CTG CCG TGT TC-3’和5’-AGGCCTGGGGAC-CCTGGGCA-3’用于第5外显子；5’-TGG TTG CCC AGG GTC CCC AG-3’和5’-GGA GGG CCA CTG ACA ACC A-3’用于第6外显子；5’-AGG CGC ACT GGC CTC ATC TT-3’和5’-AGG GGT CAT CGG CAA GCA GA-3’用于第7外显子；5’-TTG GGA GTA GAT GGA GCC T-3’和5’-AGG CAT AAC TGC ACC CTT GG-3’用于第8外显子；5’-GCA GTT ATG CCT CAG ATT CA-3’和5’-GGC ATT TTG AGT GTT AGA CT-3’用于第9外显子. PCR在20uL的反应缓冲液中进行(50μmol/L Tris, pH 9.0， 30mmol/L MgCl₂)，其中含各种引物各8pmol, dNTP各200μmol/L,37kBq的α-³²P-dATP和0.5U的Taq聚合酶. 热循环程序为：加入Taq多聚酶前于95℃循环3min，继而于94℃ 1min，60℃ 1min循环40次，每次PCR均作无DNA样本的阴性对照循环1min，观察到突变的样本DNA均重复作PCR扩增，以验证结果. 标记的PCR产物置于含有甘油的polyacrylamide凝胶上. 作SSCP和DNA测序过程中，以人胎盘DNA作阴性对照. 将不同于胎盘DNA对照的移动带洗脱提取，再作PCR分析，于94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，热循环35次. 用Wizard PCR Preps DNA纯化系统(Promega提供)纯化PCR产物作DNA测序. 基因组DNA均重复进行PCR并作SSCP分析，以排除由Taq多聚酶引入的假阳性移动带.
用于测序的引物序列为：5’-CCT CTG ACT GCT CTT TTC AC-3’用于第4外显子；5’-TGT TCA CTT GTG CCC TGA CT-3’用于第5外显子；5’-GCC TCT GAT TCC TCA CTG AT-3’用于第6外显子；5’-TGT GCA GGG TGG CAA GTG GC-3’用于第7外显子；5’-TTC CTT ACT GCC TCT TGC TT-3’用于第8外显子；5’-TTA TCA CCT TTC CTT GCC TC-3’用于第9外显子. DNA测序试剂盒由Amersham Life Science提供. 循环测序过程为：94℃热循环2min；94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 1min循环20次；94℃ 1min，72℃ 1min，72℃ 1min循环10次. 反应混合物置于60g/L的polyacrylamide测序凝胶上(由美国Diagnostics, Atlanta提供). 直接测序方法为：纯化PCR扩增产物，直接测序.

2 结果

2.1 食管鳞癌的P53基因突变受检的43例食管鳞癌中，有P53蛋白聚积的样本29例，其中的25例检出有P53蛋白突变，无P53蛋白聚集的13例，其中的5例或有缺失，或有内含子突变，或有中止密码子突变(表1). 全部受检鳞癌，总的P53突变检出率为70%(30/43)，且蛋白聚集与基因突变有明显的相关性(Fisher's T检验，表2). 有2例标本各检出2种突变，1例标本检出有3种突变. 观察到的34种突变中，发生在第5外显子的11种，第6外显子4种，第7外显子7种，第8外显子9种，4，5，6外显子各1种. 按突变性质分，其中27例为点突变(14例为G:C转化为A:T)，6例为缺失突变，1例为插入突变. 迄今在人类肿瘤中检出的P53基因突变为5961种，其中发生在175，245，248，249，273和282位密码子的突变被认为是热点突变^［⁷^］. 我们发现9例热点突变，1例位于175位密码子，2例位于248位密码子，4例位于273位密码子，2例位于282位密码子，这些密码子均编码精氨酸.

2.2 食管癌前病变的p53基因突变 本研究在癌前病变基底细胞增生、间变和原位癌中检出的p53突变率(表1，3)分别为47%(7/16)，67%(8/12)和86%(6/7). 早期病变(基底细胞增生和间变)的p53突变率通常低于较重病变(原位癌和鳞癌)的