| 100023 北京市2345信箱 | 世界华人消化杂志 1999年2月15日;7(2):161-163 |
| Email: wcjd@public.bta.net.cn | 世界华人消化杂志 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R |
| http:// www.wjgnet.com | 版权归世界胃肠病学杂志社 |
⊙研究原著⊙
树突状细胞体外诱导抗肝癌免疫
李明松 袁爱力 张万岱 刘思德 吕爱民 周殿元
第一军医大学南方医院消化科
广东省广州市
510515
李明松，男，1966-12-16生，湖北省黄陂人，1988年第三军医大学本科毕业，1993年第三军医大学硕士研究生毕业，1996年第一军医大学博士研究生毕业，讲师、主治医生，主要从事消化道肿瘤免疫治疗的基础及临床研究，发表相关论文10篇.
项目负责人 李明松，510515，第一军医大学南方医院消化科，广东省广州市白云区同和.
Correspondence to
Ming-Song Li, Department of Gastroenterology, Nanfang
Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong
Province, China
收稿日期
1998-07-07
Dendritic cells in vitro
induce efficient and special
anti-tumor
immune response
Ming-Song Li, Ai-Li Yuan, Wan-Dai Zhang, Si-De Liu,
Ai-Min Lu and
Dian-YuanZhou
Department of Gastroenterology, Nanfang Hospital, First Military Medical
University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
Abstract
AIM To induce efficient and
special anti-tumor immunological response in vivo
with dendritic cells (DCs).
METHODS Isolated
and Proliferated DCs from hepatocarcinoma patients peripheral blood; stimulated the DCs with
tumor-associated antigen (TAA)from humanhepato-carcinoma cell line HepG2;
activated the DCs with combination of granulocyte/macrophage colony stimulating
factor (GM-CSF) and interleukin 4 (IL-4); with
DCs to induce T lymphocyte to proliferate and differentiate to
cytotoxical T lymphocyte (CTL); killed HepG2 with CTL and its supernate.
RESULTS CTL
and its supernate induced by the DC whichstimulated by TAA
and activated by combination of GM-CSF and IL-4 could selectively killed HepG2
tumor cells (killing rate 92%±10.5%
and 41%±8.9% respectively).
CONCLUSION DC
from tumor patients can induce efficient and special anti-tumor immune response, which suggests that
DC, as a new concept vaccine, will play important role on therapy and
preventation against tumor.
Subject headings liver neoplasms/immunology; liver neoplasms/therapy; immunotherapy; dendritic cells; cancer raccines
Li MS, Yuan AL, Zhang WD, Liu SD, Lu AM, Zhou DY.
Dendritic cells invitro induce efficient and special anti-tumor
immune response.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi, 1999;7(2):161-163
摘要
目的
应用树突状细胞(DC)在体外诱导高效而特异抗肝癌免疫.
方法
自肝癌患者外周血中分离DC;以粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及白介素4(IL-4)联合刺激DC;以人肝癌细胞系HepG2肿瘤细胞的肿瘤相关抗原(TAA)激活DC;DC诱导自体T淋巴细胞增殖、分化为细胞毒性T细胞(CTL);检测CTL及其上清液对HepG2肿瘤细胞、LOVO肿瘤细胞及HOS-8603肿瘤细胞的细胞毒作用.
结果
经人肝癌细胞系HepG2肿瘤细胞的TAA激活并经GM-CSF及IL-4联合刺激后,肝癌患者外周血DC能够诱导自体T淋巴细胞增殖分化为CTL,该CTL及其上清液对HepG2肿瘤细胞均有高效而特异性的杀伤作用(杀伤率分别为92%±10.5%和41%±8.9%).
结论
肝癌患者外周血DC体外能够诱导高效而特异抗肝癌免疫.提示DC作为一新概念上的抗肿瘤疫苗可能在肿瘤治疗及预防中发挥重要作用.
主题词 肝肿瘤/免疫学;肝肿瘤/治疗;免疫治疗;树突细胞;肿瘤疫苗
李明松, 袁爱力, 张万岱, 刘思德, 吕爱民, 周殿元.树突状细胞体外诱导抗肝癌免疫.世界华人消化杂志,1999;7(2):161-163
0 引言
树突状细胞(DC)因其独特的免疫学特性，在启动抗肿瘤免疫反应中起关键作用［1］. 但肿瘤患者因DC免疫功能低下致宿主抗肿瘤免疫无能，因此增强DC免疫功能将增强肿瘤患者免疫功能. 研究表明，粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及白介素-4(IL-4)等细胞因子能增强DC免疫功能［2］. 但迄今未见有关肿瘤患者DC经GM-CSF及IL-4等细胞因子刺激后诱导抗肿瘤免疫反应的报道. 本实验拟应用肝癌患者外周血DC，经人肝癌细胞系HepG2肿瘤细胞的肿瘤相关抗原(TAA)激活，并经GM-CSF及IL-4联合刺激后，在体外诱导自体T淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)观察该CTL体外抗肿瘤作用.
1 材料和方法
1.1 病例选择及实验材料
临床确诊的晚期原发性肝癌患者10例，男9例，女1例，年龄28岁～65岁，平均年龄48.3岁，均未接受任何抗肿瘤治疗. 人肝癌细胞系HepG2肿瘤细胞及人骨肉瘤细胞系HOS-8603肿瘤细胞(均购自中山医科大学病理研究所). 人大肠癌细胞系LOVO肿瘤(本实验室保存).
GM-CSF，IL-4(均为DAKO公司产品). 抗CD83单克隆抗体(McAb, Duke university, Thomas F. Tedder, Ph.D.惠赠). 异硫氰酸荧光素(FITC，SIGMA公司产品).3H-TdR(北京原子能研究所产品).
1.2 实验方法 自肝癌患者外周血中分离并纯化外周血单个核细胞(PBMC)、T淋巴细胞［3］.
主要步骤如下：以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)；聚丙烯Petri培养皿培养选择性地除去巨噬细胞；尼龙毛柱过滤除去B细胞；与L-亮氨酸-L-亮氨酰甲基酯共培养选择性除去其中的巨噬细胞、NK细胞及细胞毒性T细胞，余下细胞则主要为T淋巴细胞. 肝癌TAA获取［1，4］：常规培养并收集HepG2肿瘤细胞；低渗冻融HepG2肿瘤细胞，高速离心(10000rpm)并收集HepG2肿瘤细胞碎片作为TAA. TAA刺激DC，制备TAA特异性的DC［1］：TAA(源于1×106
HepG2肿瘤细胞)与PBMC(1×106，含DC)于GM-CSF(50ng/mL)，IL-4(100u/mL)，37℃，10%
CO2环境中培养24h. PBMC与GM-CSF及IL-4体外共培养以制备高免疫活力的DC［2]：PBMC(105/mL)，GM-CSF(100ng/mL)及IL-4(1000u/mL)于37℃，5% CO2环境中培养24h. 以抗CD83 McAb特异显示DC.
TAA特异性的DC激活T淋巴细胞增殖分化为CTL［1，4］：于多孔板中加入T淋巴细胞(1×105，作为反应细胞)、DC(5×103，作为刺激细胞)，在IL-2
(100u/mL)存在的条件下置37℃，10% CO2环境中培养；于培养后d5分别收集T细胞及其上清液，RPMI-1640稀释T细胞备用. 细胞毒实验［1，4］：DC激活的CTL与HepG2肿瘤细胞于培养皿中共培养，定性观察CTL对HepG2肿瘤细胞的细胞毒作用. 以被DC激活的CTL作为效应细胞，3H-TdR标记的HepG2肿瘤细胞、HOS-8603肿瘤细胞及LOVO肿瘤细胞作为靶细胞，效靶比为50∶1进行细胞毒实验. 以培养DC激活的CTL上清液为杀伤因子，3H-TdR标记的HepG2肿瘤细胞、HOS-8603肿瘤细胞及LOVO肿瘤细胞为靶细胞进行细胞毒实验.
分别以DC及未经DC激活的T淋巴细胞为效应细胞，3H-TdR标记的HepG2肿瘤细胞作为靶细胞，效靶比为50∶1进行细胞毒实验. β液闪计数仪测定每分钟计数(cpm). 效应细胞对靶细胞的杀伤率表达为：(细胞毒实验前靶细胞cpm-细胞毒实验后活靶细胞cpm)/细胞毒实验前靶细胞cpm×100%.
统计学处理所有变量均表达为x±s，以t检验分析两变量间差异性.
2 结果
PBMC与GM-CSF及IL-4共培养后，PBMC中的DC优势增殖，PBMC由1×106增至1.8×106，经抗CD83特异显示，共培养后的PBMC中DC纯度为83%.
经GM-CSF及IL-4共培养后肝癌患者DC能够刺激自体T淋巴细胞增殖，T淋巴细胞数量由刺激前的1×105增至刺激后的2.4×105，两者相差非常显著及显著(P＜0.01).
DC诱导的CTL与HepG2肿瘤细胞共培养后，CTL对HepG2肿瘤细胞具有强烈的杀伤作用，CTL上清液对HepG2肿瘤细胞生长亦有较明显的抑制作用. 见表1.细胞毒实验显示DC诱导的CTL对HepG2肿瘤细胞具有明显杀伤力，但对HOS-8603肿瘤细胞及LOVO肿瘤细胞仅有微弱杀伤力. 见表1.
DC本身及未经DC激活的T淋巴细胞对HepG2肿瘤细胞无杀伤作用. 见表1.
表1
DC激活的CTL及其上清液对HepG2及HOS-8603杀伤力
| 效应细胞及细胞因子 | 靶细胞 | 杀伤率(%) |
| CTL | HepG2肿瘤细胞 | 92±10.5 |
| CTL | HOS-8603肿瘤细胞 | 18±11.2 |
| CTL | LOVO肿瘤细胞 | 13±9.8 |
| CTL上清液 | HepG2肿瘤细胞 | 41±8.9 |
| CTL上清液 | HOS-8603肿瘤细胞 | 12±9.3 |
| CTL上清液 | LOVO肿瘤细胞 | 9±5.7 |
| DC | HepG2肿瘤细胞 | 0 |
| 未激活的T淋巴细胞 | HepG2肿瘤细胞 | 0 |
3 讨论
本实验结果显示，肝癌患者的PBMC在体外经GM-CSF及IL-4共同刺激能产生大量具高免疫活力的DC，该DC经HepG2的TAA刺激后能够诱导自体T淋巴细胞增殖分化为CTL，CTL及其上清液具有高效而特异抗肝癌作用.
近期研究表明肿瘤患者DC免疫功能低下，同时在动物及正常成人中发现联合应用细胞因子能增强DC免疫功能并促进DC优势增殖. 本实验联合应用GM-CSF及IL-4从肝癌患者外周血中培养出大量DC，该DC经TAA刺激后能诱导自体T细胞增殖分化为CTL. 表明肿瘤患者DC免疫功能在适当细胞因子的联合作用下能够得到增强. 本实验结果还显示经HepG2肿瘤细胞TAA刺激后，肝癌患者DC诱导的CTL对HepG2肿瘤细胞具有强大的杀伤作用，而对HOS-8603肿瘤细胞及LOVO肿瘤细胞则明显减弱，表明DC诱导的CTL具有高效的特异的抗肿瘤作用. 同时，肝癌患者DC诱导的CTL上清液对HepG2肿瘤细胞生长具有较强的抑制作用，提示DC诱导的CTL不仅通过CTL本身而且通过CTL分泌的细胞因子发挥抗肿瘤作用. 而经HepG2肿瘤细胞TAA刺激的肝癌患者DC诱导的CT及其上清液对HOS-8603肿瘤细胞及LOVO肿瘤细胞尚有微弱的杀伤作用，推测可能是CTL及其上清液对肿瘤细胞的非特异性细胞毒作用. 有关DC诱导的CTL抗肿瘤作用的具体机制目前尚不清楚，除CTL直接杀伤肿瘤细胞外，可能尚有CTL及其分泌的细胞因子诱导肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤细胞增殖等机制存在. 相关实验正在进行中.
DC诱导的CTL的特异性抗肿瘤作用依赖于特异性的TAA. 目前已经确认肿瘤细胞存在TAA［6]. 该类抗原不仅存在于肿瘤细胞外，而且存在于肿瘤细胞内，并且后者具有较强的抗原性. 以低渗冻融HepG2肿瘤细胞方法获取TAA虽然可能丢失部分小分子量抗原肽，但经高速离心可尽量避免丢失抗原