⊙研究论文⊙

冬虫夏草与秋水仙碱抗肝纤维化的对照研究

王要军, 孙自勤, 权启镇, 张志坚

项目负责人:王要军，男，1965-01-04生于山东省鄄城。现任济南军区总医院消化科主治医师，除从事消化病的临床工作外，主要进行慢性肝病及肝癌的发病机制研究。发表论文20篇，现正在进行原发性肝癌癌基因表达及其预后因素的研究。
［济南师范路98号，电话：5952171-69616］


摘要
目的：以秋水仙碱为对照，观察冬虫夏草对实验性肝纤维化的治疗效果，并探讨其机制。

方法：用CCl₄诱导大鼠肝纤维化，分别以生理盐水、秋水仙碱、冬虫夏草各24只进行治疗。实验wk4, wk8, wk12, wk14, 分批处死动物，测量血清III型前胶原含量，取肝组织进行病理观察，并用免疫组化技术观察肝组织I,III,IV型胶原，结蛋白阳性细胞的动态变化。

结果：两种药物均能明显降低血清III型前胶原含量，并减轻肝组织I,III,IV型胶原的沉积，最终防止肝假小叶及肝硬变形成。动物经药物治疗后肝组织内结蛋白阳性细胞数均明显低于生理盐水组。

结论：冬虫夏草与秋水仙碱均有良好的抗肝纤维化作用，它们能抑制肝内储脂细胞(结蛋白阳性细胞)的增殖和转化，从而减少胶原合成及在肝窦周沉积。冬虫夏草无毒副作用，可能是一种有前途的抗肝纤维化药物。

主题词 冬虫夏草;秋水仙碱;肝纤维化;大鼠

王要军, 孙自勤, 权启镇, 张志坚.冬虫夏草与秋水仙碱抗肝纤维化的对照研究.新消化病学杂志,1994;2(4):208-209

AIM To study on the effects of cordyceps sinensis in liver fibrosis, and its mechanism. Colchicine was used as control therapy.

METHODS Liver fibrosis was induced by CCl₄ in Wistar rats. The animals were treated with cordyceps sinensis (n=24), colchic ine (n=24), and normal saline (n=24), respective ly. The rats were killed in batches at 4.8.12.14 weeks. Serum procollagen I (PC III) was measured by radioimmunoassay and liver tissue was observed pathologically. Dynamic changes of type Ⅰ，III,IV collagens and desmin-positive cells in liver tissue were studied by immunohistochemical technique.

RESULTS Cordyceps sinensis and colchicine were both able to mar kedly reduce serum PC III level, and reduce I,III,IV collagen deposition in liver tissue, and then prevent the formation of pseudo-lobule and cirrhosis. Desmin-positive ce ll number in liver tissue in two treated groups was much lower than that in normal saline one.

CONCLUSION Both Cordyceps sinensis and colchicine had satisfact ory effect on hepatic fibrosis. They can inhibit proliferation and transition of hepatic fat-storing cells (desmin-positive cells), so as to reduce collage n synthesis and deposition in liver. Cordyceps sinensis may be a useful anti-fibrotic drug in chronic liver diseases as it has no side-effect.

Keywords cordyceps sinensis;colchicine;rat;liver fibrosis

Wang YJ, Sun ZQ, Quan QZ, Zhang ZJ. Controlled study of Cordyceps sinensisand colchicine on the antifibrosis effect of liver. Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1994;2(4):208-209


目前对肝纤维化的治疗尚无有效药物。秋水仙碱(colchicine, Col)是广泛推崇的抗肝纤维化药物，但该药副作用较多，临床上难以推广。冬虫夏草(虫草，cordyceps sinensis, CS)具有一定的抗肝纤维化作用，但其确切疗效和机制尚不清楚^［1］。本文拟比较 Col和CS抗肝纤维化效果，并探讨其作用机制，以期对临床抗肝纤维化提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料 雄性Wistar大鼠72只，体重160g～280g，购自山东省医科院。鼠抗人结蛋白、IV型胶原单克隆抗体均为Dako公司产品，兔抗牛III型前 胶原肽抗体由第二军医大学长征医院临床免疫中心提供，I型胶原抗体由 日本Yamamoto惠赠，ABC试剂盒系Vector产品，血清I型前胶原(PC III)放免试剂盒由重庆肿瘤研究所提供。虫草为市售天然正品，研碎制成混悬水溶液。

1.2 方法
1.2.1 动物处理 随机分为3组，每组24只。CS组：皮下注射40% CCl₄花生油溶液1.2mL/kg体重，2次/wk，共12wk，实验开始时即给动物CS 1 g灌胃，3次/wk，共14 wk。Col组：注射CCl₄同前，给予Col 40μg/kg体重，灌胃，3次/wk，共14wk。生理盐水组(NS组)：动物注射CCl₄同前，以NS灌胃。每组每次6只动物分别于实验wk4, wk8, wk12, wk14, 处死，心内抽血测定血清PC III，取肝组织，10%中性福尔马林固定，常规石蜡切片 ，进行普通病理及免疫组化研究。
1.2.2 免疫组化染色 I，IV型胶原，III型前胶原肽(P III P)及结蛋白免疫组化染色采用ABC法^［2］。结蛋白阳性细胞计数方法同文献^［3］。
1.2.3 血清PC III 放免测定，参考试剂盒说明。
1.2.4 统计学处理 非配对计量资料t检验。

2 结果

2.1 血清PC III检测结果见表1。

2.2 肝组织中结蛋白阳性细胞数变化见表2。

2.3 肝病理学及胶原的变化 wk4：NS组全小叶肝细胞肿胀变性，散在肝细胞核固缩、崩解，汇管区胶原IV, P III P明显增多。窦周胶原I, P III P均较正常肝增多，未见I型胶原，炎细胞浸润区可 见P III P分布及少量I型胶原。Col和CS组仅见近中央静 脉处约1/3区域肝细胞肿胀变性，很少见肝细胞崩解现象。窦周胶原与NS组无差别，但汇管区无胶原增多现象。wk8：NS组Ⅳ型胶原及P III P在窦周进一步增加，IV型胶原 呈连续网状分布，窦周并见IV型胶原。自汇管区有细纤维隔沿肝界板延伸，但未形成完整分隔，纤维隔内P III P强阳性、IV型胶原 染色较弱。纤维隔内有IV型胶原及P III P免疫染色阳性的 成纤维细胞，靠近肝界板处的散在肝细胞内可见IV型胶原染色，而无P III P。Col和CS组汇管区见胶原增多，自汇管区可见胶原纤维沿肝界板延伸，尚未形成纤维隔，故而呈“芽”状。个别肝小叶“芽”较长形似细纤维隔。窦周胶原染色明显弱于NS组。肝细胞内未见IV型胶原。wk12：NS组较多肝小叶有完整纤维隔形成，并有少数假小叶形成。 窦周IV型胶原同wk8，P III P和I型胶原进一步增加，肝细胞再生旺盛。Col和CS组均见纤维隔进一步延伸，未见完整分隔 形成，胶原分布基本与wk8相同。wk14：NS组有多数假小叶形成，肝窦周P III P染色较12wk时减弱。I型胶原染色增强，呈连续粗网状分布，纤维隔也以I型胶原为主。Col和CS组纤维隔无进一步延伸，隔内及窦周仍以P III P为主，与Col组相比，此期CS组可见汇管区I，III型胶原明显吸收减少，窦 周IV型胶原呈不连续细网状，与正常鼠肝类似。

表1 血清PC含量  n=6, x-±s, μg/L)

^*P＜0.01, vs NS组；P＜0.05，vs Col组。

表2 肝组织中结蛋白阳性细胞的变化  (n=6, x-±s)

^*P＜0.05，vs NS组；^**P＜0.01,P＞0.05, CS vs Col。

3 讨论

P III P是PC III的代谢物，两者在肝组织中分布相一致。血清P III P和PC III被认为是较好的反映肝纤维化程度的指标，并能较准确地反映药物治疗肝纤维化的效果^［4］。血清PC III比P III P更为敏感。Col和CS组实验各期血清PC III 均低于NS组，结合普通病理观察及免疫组化各型胶原的动态变化，我们认为虫草与秋水仙碱均有确实的抗肝纤维化作用，并防治假小叶及肝硬变形成在治疗后期CS并能促进胶原成分的吸收。CS与Col组之病理改变及血清PC III无明显差别。各种致病因素造成的肝纤维化均是因肝窦周细胞外基质，尤其是胶原基质的过度沉积所致。引起肝纤维化的胶原主要是I，III，IV型。III，IV型沉积较早，晚期肝窦周才有I型胶原的沉积，胶原沉积使肝窦周形成连续的基底膜样结构，称之为肝窦毛细血管化，这种病理改变使肝血流和结构紊乱加剧，形成恶性循环，最终形成肝硬变。I型胶原的沉积标志着肝纤维化的不可逆转，称之为“纤维化胶原” ^［5］。CS和Col均可抑制肝窦周I，III，Ⅳ型胶原的沉积，阻止肝纤维化形成，机制可能是它们抑制储脂细胞(fat-storing cells, FSC) 的增殖和转化。FSC是位于狄氏间隙的肌纤维母细胞，在纤维化时增 殖、激活后合成大量I，III，Ⅳ型胶原，沉积于肝窦，也有人认为FSC激活是造成肝纤维化最终的共同途径^［6］。光镜下鉴别FSC最可靠的依据是它含有结蛋白。实验发现Col治疗8wk后，CS治疗12wk后肝组织中结蛋白阳性细胞明显少于NS组(P＜0.01)，在 此之前，结蛋白阳性细胞虽与NS组无统计学差别，但数量明显减少。Col与CS组实验各期均 无差别(P＞0.05)。说明Col与CS均能抑制FSC的增殖，它们也能抑制FSC向成纤维 细胞转化(另文报道)，从而减弱FSC合成胶原能力，这可能是其主要的机制之一。Col具有较 多副作用，临床难以推广应用，而CS是滋补型中药，无副作用，可能是一种有前途的抗肝纤 维化药物。

4 参考文献
1 蔡卫民. 肝硬变研究的某些进展. 肝病与胃肠病学杂志，1992；1(1)：11-17
2  王要军，戴益民，张力. 人原发性肝癌组织I、III型胶原的免疫组化研究. 实用癌症杂志，1993；8(2)：65-68
3  王要军，孙自勤，权启镇，等.汉防己甲素治疗大鼠实验性肝纤维化的研究.临床肝胆病杂志，1993；9(增刊)：40-41
4  孙自勤，权启镇.肝纤维化血清学诊断进展.临床肝胆病杂志，1993；9(3)：175-178
5  王要军，于峻基，戴益民.储脂细胞与肝纤维化.临床肝胆病杂志，1993；9(3)：182-184
6  Burt A, Path M, Bail B, et al. Morphologic investigation of sinusoidalcells. Semin Liver Dis, 1993；13(1)：21-38