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杨倩,
成军, 刘妍,
洪源, 王建军,
党晓燕,
中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室
北京市 100039
张树林,
西安交通大学第一医院传染科
陕西省西安市
710061
项目负责人:
成军, 100039, 北京市西四环中路100号,
中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室.
cj@genetherapy.com.cn
电话:
010-66933391 传真:
010-63801283
收稿日期:
2003-06-24 接受日期:
2003-07-16
杨倩,
成军, 刘妍,
洪源, 王建军,
党晓燕, 张树林.
丙型肝炎病毒与PKR信号转导系统.
世界华人消化杂志
2004;12(1):149-151
http://www.wjgnet.com/1009-3079/12/149.asp
0 引言
在病毒感染真核细胞的过程中，干扰素(IFN)诱导细胞的抗病毒机制是机体防御感染的第一道防线.
在病毒感染过程中，分泌的干扰素主要用于保护邻近细胞免受感染，限制病毒扩散[1].
Ⅰ型IFN由IFN-a、IFN-b两种亚型组成，IFN-a主要由白细胞分泌产生，IFN-b主要由成纤维细胞、上皮细胞产生.
Ⅰ型IFN与相应的受体结合，激活信号级联反应，从而调节至少30个基因的转录翻译水平，其中包括双链RNA激活的蛋白激酶(double-stranded
RNA-activated protein kinase，PKR)和２’-5’寡聚腺苷酸合成酶(２’-5’oligoadenylates
synthesis)，这两种酶的激活均需要病毒复制过程中产生的双链RNA[2,
3]. PKR参与机体的抗病毒机制，与细胞凋亡密切相关，从而受到越来越多的关注.
1
PKR的结构与生物学特点
PKR是经典的IFN诱导产物，参与IFN的抗病毒机制.
PKR又称为DAI或p68,由551个氨基酸残基组成,其N端为调节区(1-265
aa)，具有两个与dsRNA结合的部位，分别位于55-75
aa及145-166 aa区域内，其中前一个区域是必需的;
其C端(266-551
aa)为催化部位.
PKR分子量为68
kDa，属于保守双链RNA结合分子家族，该家族还包括大肠杆菌RNA酶III等[4].
Jiménez-García
et al [5]通过比较腺病毒2感染和未感染的HeLa细胞发现，在未感染的细胞中PKR分布在细胞质，同时也发现PKR在核浆中也有散在分布，感染细胞与未感染细胞有相似的细胞分布.
研究表明低浓度的dsRNA具有激活作用，然而高浓度的dsRNA却阻止该活化作用.
目前认为dsRNA对PKR的激活与双链RNA长度有关，而与序列结构无关，激活PKR最少需要30
bp dsRNA，随着dsRNA的延长激活能力逐渐增强.
但有学者发现含有双链长度不超过20
bp的单链Tm1-3RNA亦能激活PKR，提示PKR的激活可能存在多种形式.
PKR与dsRNA结合后，形成二聚体，随后进入自主磷酸化和随后的不依赖dsRNA的底物磷酸化，PKR的N端有两个保守的dsRNA结合基点(motif)，第一个基点含有与dsRNA结合的高度保守性氨基酸序列;
C端为催化活性结构域，但这一活性在dsRNA结合前是封闭的，当N端基点上结合dsRNA后，可能通过蛋白质构型的改变，使C端的酶活性表现出来[6-10].
活化的PKR能够识别蛋白质合成的起始因子真核翻译起始因子-2(
eukaryotic initiation factor-2，eIF-2)，并使eIF-2的a亚基51位丝氨酸磷酸化.
异源二聚体的eIF-2能够结合GTP和tRNA，形成三元复合物.
该复合物与40
s核糖体亚单位结合形成一个43
s的复合物[11].
43 s的聚合物参与识别mRNA起始密码子，结合60
s核糖体亚单位同时伴随GTP的水解转变为GDP.
在下一个同样的循环开始前，与eIF-2结合的GDP在eIF-2B催化作用下由GTP替代.
eIF-2a亚基51位丝氨酸磷酸化将大大提高GDP对eIF-2的亲和性，使GDP与GTP的交换受到阻滞.
虽然eIF-2-GDP与eIF-2B能够形成稳定复合物，但由于在细胞中eIF-2的含量远远高于eIF-2B，因此比例较少的eIF-2磷酸化即可阻断细胞中eIF-2B的催化作用.
PKR催化eIF-2a51位苏氨酸磷酸化，改变eIF2功能，阻止eIF2B发挥作用，从而降低eIF2-GTP的水平，使蛋白合成和病毒复制水平下降[12-15].
最近研究还发现在肿瘤坏死因子-a、dsRNA、病毒感染等刺激下，激活的PKR可以诱发凋亡.
这一发现提示PKR除了阻断病毒蛋白合成外，还可以通过诱发凋亡发挥抗病毒作用.
PKR诱发凋亡机制与其磷酸化eIF-2a、激活NF-kB和p53有关[16-18].
实验发现: 表达51
aa发生丝氨酸→丙氨酸替换的eIF-2a变异体的NIH3T3细胞可以抵抗血清缺失和肿瘤坏死因子-a诱导的凋亡[19];
在HeLa细胞中同样变异体的表达亦可保护细胞由PKR大量表达诱发的凋亡[20];
51 aa发生丝氨酸→天冬氨酸替换的eIF-2a变异体功能与磷酸化eIF-2a相似，表达该变异体的COS-1细胞可以诱导凋亡发生[21].
这些研究结果显示eIF-2a可以直接诱发凋亡产生.
机制可能与磷酸化eIF-2a诱导一些与凋亡相关的mRNA优先表达相应蛋白有关，这与酿酒酵母氨基酸缺乏反应相似，Bcl-2家族中的Bax的表达可能与此有关[22].
此外，PKR还可以激活与炎症、凋亡密切相关的NF-kB、p53及IRF1.
NF-kB异源二聚体与Ikb结合时处于无活性状态，当与激活因子发生反应时，磷酸化Ikb发生遍在蛋白依赖的蛋白酶体降解，使得NF-kB转位核内.
PKR在细胞内促使Ikb磷酸化和激活NF-kB，目前认为是通过直接磷酸化Ikb磷酸激酶复合物而发挥作用，缺乏PKR的细胞不能对dsRNA产生抑制[23-25].
PKR可以激活p53，具体机制尚不明确，PKR磷酸化p53蛋白392位丝氨酸可能与其调节p53功能有关，在缺乏PKR的细胞p53的功能受到损伤.
2
PKR与丙型肝炎的关系
在病毒感染机体的过程中，病毒常常发生变异抵抗PKR介导的抗病毒机制，主要表现为以下几种方式:
(1)产生拮抗dsRNA的RNA或蛋白，阻止PKR的活性;
(2)产生dsRNA结合蛋白，隔离与PKR结合;
(3)产生蛋白阻止PKR二聚体化;
(4)产生蛋白干扰PKR与eIF2的结合;
(5)激活磷酸酶使PKR和eIF2去磷酸化;
(6)阻止PKR的表达或诱导PKR降解[26-28].
丙型肝炎病毒(HCV)属黄病毒属家族，可引起机体的持续性感染，导致慢性肝炎和肝硬化，并与肝细胞癌、淋巴细胞增生紊乱密切相关.
目前惟一有效的治疗途径是运用干扰素，但是大多数患者对治疗无明显反应[29-31].
其中病毒发生变异逃避PKR抗病毒作用，是其抵抗干扰素治疗的主要机制之一.
NS5A和E2两种蛋白参与调节机体对dsRNA的反应，研究表明这两种蛋白能够与PKR结合，并阻止其发挥抗病毒作用.
同时分子流行病学研究发现NS5A或
E2序列，特别是与PKR结合的区域，与病毒的持续感染、对干扰素治疗的反应有紧密的联系[32].
这些发现表明病毒的持续感染机制之一，可能与NS5A和E2阻止激活的PKR引发的抗病毒作用有关.
E2是病毒的包膜蛋白，参与病毒与靶细胞的结合，在丙肝病毒不同株之间E2具有高变的特点，Taylor
et al [33]研究E2在干扰素抵抗中的作用发现，来自不同病毒分离株E2均含有一个12氨基酸的序列，该序列与PKR
自磷酸化位点、eIF2磷酸化位点相似，该序列在不同株之间高度保守.
实验证实PKR与E2能够在体外结合，体内、外实验均证实E2可以阻断PKR的活性;
Pflugheber et al [34]构建包含HCV复制子的Huh7细胞系，将其中一个命名为10A，包含的病毒复制子编码氨基酸(aa)序列中于2
040位插入赖氨酸，该位点靠近的氨基末端;
另一个命名为H27，包含的病毒复制子于2
198位发生亮氨酸(L)与丝氨酸(S)的替换，该位点邻近PKR结合区域;
细胞培养结果表明10A复制水平超过H27的５倍.
为了进一步明确病毒复制水平与NS5A、PKR之间的关系，Pflugheber
et al利用免疫共沉淀技术发现与Huh7细胞相比，H27细胞产生的PKR水平升高显著;
当在这两种细胞系中加入dsRNA后，PKR的活性明显升高;
而在10A细胞系中PKR呈现出低度的活性，对dsRNA刺激无明显反应，当加入NS5A抗体后PKR活性恢复.
PKR与NS5A在10A细胞中的亚细胞定位相互重叠，而在H27细胞中却无此现象出现.
由此研究者认为由10A细胞病毒复制子编码的NS5A能够与PKR结合并且抑制其活性.
同时研究者也注意到在两种不同的病毒复制子中都包含有64个aa组成的PKR结合域，但发生L2198S替换或其他紧邻PKR结合区域的aa替换，可能会改变NS5A对PKR结合、调节.
PKR的激活在不同的病毒、不同的宿主之间将产生截然不同的结果.
进一步对PKR作用机制及其信号传导通路的研究，明确其抗病毒的具体机制，为发展新的治疗策略提供新的方向.
3
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