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党晓燕，成军，中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室
北京市 100039
邓红，西安交通大学第二医院感染科，陕西省西安市
710004
项目负责人:
成军,
100039, 北京市西四环中路100号,
中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心,
全军病毒性肝炎防治研究重点实验室.
cj@genetherapy.com.cn
电话:010-66933392
传真:
010-63801283
收稿日期:
2003-06-07 接受日期:
2003-07-01
党晓燕,
成军, 邓红.
多嘧啶序列结合蛋白与丙型肝炎病毒的关系.
世界华人消化杂志
2003;11(12):1956-1959
http://www.wjgnet.com/1009-3079/11/1956.asp
0 引言
多嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine
tract binding protein，PTB)，在大多数哺乳动物细胞及人类原始肝细胞的胞核及胞质中均可检测到，其分子量约为57
kD，故也有人称之为p57.
PTB在稳态时定位于核内[1]，且可通过能量依赖机制快速穿梭于细胞的胞质及胞核.
PTB作为一种普遍存在的多效应细胞因子，作用于多种病毒.
在核内参与前-mRNA的选择性剪接，在胞质中调节包括丙型肝炎病毒(HCV)在内的多种病毒的翻译和复制过程.
因此，PTB 在HCV
RNA的转录后调节过程中发挥作用.
对PTB与HCV的相互作用进行研究有助于进一步明确丙型肝炎及其相关疾病的分子生物学机制.
1
PTB的结构及功能
PTB是异源性细胞核核糖蛋白(hnRNP)家族的一员[2]，是结合于RNA或单链DNA嘧啶富集序列的蛋白.
PTB有3种亚型:
PTB1、PTB2和PTB4[3-5].
PTB的原型(PTB1)含有531个氨基酸残基(aa)，也即所熟知的p57.
PTB2及异源性细胞核核糖蛋白I即PTB4，是在PTB1的第291位氨基酸残基之后分别插入19及26个aa
[3, 5]. 在PTB的分子结构中含有1个核转出信号(NES)和4个松散的保守RNA识别基序(RRMs).
正如生化及基因方法研究结果显示，PTB以低聚体或单体形式存在.
全长的PTB以三聚体或更复杂的复合体存在，而不是以二聚体形式存在.
相反，切去上游的PTB(169-293
aa)，则形成二聚体而不是更大的复合体.
PTB的很小片段(1-169
aa)及PTB的核心部分(169-293
aa)也以二聚体形式存在[6].
PTB的核心部分(169-293
aa)在PTB-PTB的相互关系中发挥重要作用，且其N-末端及C-末端增强了这种相互作用，并发现PTB的核心部分在寡聚化中发挥重要作用[7].
通过Hela细胞的细胞因子可知PTB的C-末端(329-530
aa)显示出强烈的RNA结合活性，PTB的N-末端有增强RNA结合的作用.
在翻译过程中PTB的寡聚物发挥重要作用.
Brunel et al [8]报道 PTB是一种结合于RNA或单链DNA的普遍存在的细胞因子.
其以灵敏的转移方式在核与胞质内快速穿梭[2].
PTB的功能与不同的亚细胞定位相关.
PTB在核内涉及调节许多基因前-mRNA的选择性剪接[9]，调节前-mRNA多聚腺苷酸化作用[10]，在胞质中与mRNA的内核糖体进入位点(IRES)相互作用调节RNA的翻译和复制[11].
首先证实PTB为一种结合于多嘧啶序列的蛋白，在这个基础上，提出PTB是一种剪接因子[3,
4]，最近表明PTB与多嘧啶序列结合抑制了内含子的选择性剪接[12,
13]. Witherell et al [14]认为其他细胞因子的存在增加了PTB的RNA结合特异性.
2
HCV的结构及其与PTB的相互作用
HCV基因组为全长9.4
kb的单股正链RNA，含有一个大的开放读码框架，编码一个约3
010-3 033个aa的病毒前体蛋白[15].
这个多聚蛋白在多位点被切割可产生至少10种结构及非结构蛋白[16].
HCV RNA翻译起始点上游的341
nt称为5’-非翻译区(5’-NTR)，控制着HCV
RNA的翻译调节过程.
HCV基因组的3’-末端为3’-非编码区(3’-NTR)，其核苷酸序列自身能够相互结合，形成复杂的二级结构，以多聚尿嘧啶或多聚胞嘧啶的同聚物序列结尾[17].
在各种HCV分离株中，虽然HCV
RNA的全长序列中的编码区表现出明显的多样性，但是5’-NTR
和3’-NTR是高度保守的[18-20]
. 这些核苷酸片段的生物学功能与HCV
RNA复制有关，受肝细胞内HCV
RNA结合蛋白的调节.
PTB作为RNA结合蛋白与HCV
RNA的5’-非翻译区、3’-末端的98个核苷酸(X区)及核心蛋白PTB的结合区域相结合调节HCV的翻译及合成.
因此可以说PTB参与了HCV的转录后调节.
HCV
RNA 3’-NTR包含有三个结构区域:
21-39 nt的高度变化序列，紧接的为长度可变的(73-98
nt)UC富集序列及98个核苷酸(X区)的高度保守序列区[19,
20]. 已知HCV
3’-NTR无多聚的腺嘌呤(A)尾
，但有一个可变的多聚尿嘧啶胞嘧啶(U-C)序列和在
3’-末端保守的X区[19,
20 ]. 在哺乳动物细胞中证实X区的存在可使HCV翻译提高2-3倍.
3’-末端的X区含有三个茎环结构(stem-loop
structure)，SL1，SL2，SL3.
有人证实PTB充分作用于3’-X区的SL1及过渡区域的序列.
Ito et al [21]研究显示一个58
kD的细胞蛋白结合于这个HCV
RNA 3’-末端X区5’-端的19
nt和过渡区域的7个侧翼核苷酸，被证实为多嘧啶序列结合蛋白，PTB在大多数哺乳动物细胞系及人类原始肝细胞中在胞核及胞质中均可检测到.
结合这种蛋白需要HCV
RNA X区的98 nt的两个茎环结构及其特异性的序列.
PTB结合于X区，识别这个区的初级结构和茎环结构[21,
22]. Chung et al [23]研究发现PTB与HCV
3’-NTR的 结合需要上游两个茎环结构(SL2和SL3)，而不是3’-末端最多的茎环(SL1).
表明HCV RNA
3’-UTR紧密的二级结构是与PTB之间结合必不可少的条件.
SL2或SL3中茎或环的较小改变会严重削弱hnRNPI/PTB的结合.
PTB与HCV
RNA 3’-NTR相互作用调节翻译，需要极稳定的RNA结构.
Ito et al [21]研究表明3’-末端的缺失并不影响PTB结合，除非3’-末端的缺失多于56
nt. PTB在X区5’-末端的42
nt含有最小结合域.
截断的X区5’-末端的RNAs不能结合PTB.
X区的初始的21
nt含有对于PTB结合必需的关键序列.
而且，X区31-40
nt的缺失几乎完全丧失了与PTB的结合能力，因此X区内部序列(30-50
nt)对蛋白的结合是关键的.
Chung et al [23]认为 PTB强烈的选择性及优先结合于HCV基因组的3’-末端暗示其或许参与了病毒的复制，有助于负链RNA合成的直接启动，稳定病毒的基因组，和/或调节基因组RNA的包衣壳作用.
Tsuchihara et al [22]研究表明除了HCV
3’-X区的5’-末端结合于PTB，HCV
基因组的多聚尿嘧啶序列也与PTB相互作用.
Ito et al [24]研究表明X区在体内或体外可提高HCV
RNA的翻译. 而且，当PTB结合点在RNA存在时，此前报道的HCV
3’-NTR翻译增强作用变得更加明显.
因此这个提高至少部分被PTB与X区的相互作用介导.
丧失了PTB结合的突变体，但不是完全丧失，降低了翻译的提高程度.
HCV RNA的X区与其RNA-结合蛋白，能刺激HCV
RNA的IRES依赖的翻译.
然而，PTB结合位点的突变并不使X区的翻译提高活动完全丧失，这或许归因于剩余PTB的结合能力[21].
HCV 5’-NTR长度范围在332-343
nt之间，含有5个AUG密码子[18].
这个序列是高度保守的[25]，并折叠成一个复杂的二级结构，包括多个茎环结构和一个RNA假结.
HCV开放读码框架的翻译是位于5’-NTR
的IRES介导的帽不依赖IRES机制启动的[26,
27]. Tsukiyama-Kohara et al [26]也证实HCV
5’-NTR如细小核糖核酸病毒一样[28]，能够以IRES方式调节翻译的启动.
PTB被认为是一个翻译因子[14,
29-34]，结合于包括HCV在内的几个RNA
病毒的IRES 区，调节他们的翻译[29,
30]. 且要求IRES的初级结构、二级及三级结构必须也是高度保守的，以维持IRES的正确功能
[26, 35-37].
Ito et al [24]认为 HCV
X区特异的提高了HCV
RNA 5’-末端的依赖IRES的翻译.
这种效果不依赖HCV
RNA 5’-末端的初级序列.
表明这个提高的效果不归因于X区介导的对RNA稳定化.
且这个效果仅仅是顺式作用的结果.
翻译提高的最可能机制是X区与IRES相互作用.
IRES与X区的相互关系或许由PTB和其他蛋白介导，然而X区的突变降低了翻译提高的水平，但并没有完全丧失.
有数据表明PTB与X区的结合要比与HCV
的5’-NTR 牢固至少100倍[38].
因此，在翻译的提高作用中，PTB与X区的结合或许是最重要的因子.
Gosert et al [39]研究表明PTB的过度表达可刺激HCV
由IRES介导的翻译.
核心蛋白编码序列的5’-末端是HCV
RNA IRES结构的部分[40,
41]，核心蛋白编码序列的3’-末端有很强的PTB结合点[38].
最近有人发现在RNAs
中核心蛋白编码区对于X区翻译提高的效果是重要的[38].
Ito et al [38]认为位于核心蛋白末端的PTB结合位点对HCV
IRES 的活动起调节作用.
另外，还发现在HCV
RNA的核心蛋白编码区有一个更加坚固PTB的结合位点.
这个结合区域位于核心蛋白编码区的3’-末端，在HCV的分离群中含有高度保守的嘧啶富集序列.
因为核心蛋白编码序列的5’-末端是HCV
RNA的IRES结构的一部分，表明核心蛋白在HCV
RNA翻译提高中具有重要作用.
在体外的翻译研究过程中发现核心蛋白编码区的PTB结合序列强烈的抑制HCV
RNA 的翻译，这种抑制在3’-末端X区存在的情况下可被缓解.
且当PTB结合点在RNA存在时，以前报道的HCV
3’-NTR的翻译增强作用变得更加明显.
这些结果表明PTB结合于HCV
RNA的内部位点提供了HCV
翻译调节的另一种机制.
更加表明了在翻译的提高中PTB-X
区相互作用的重要性.
3
参考文献
1
Valcarcel J, Gebauer F. Post-transcriptional regulation: the dawn
of PTB. Curr Biol 1997;7:705-708
2 Michael WM, Siomi
H, Choi M, Pinol-Roma S, Nakielny S, Liu Q, Dreyfuss G. Signal sequences
that target nuclear import
and nuclear export of pre-mRNA-binding
proteins. Cold Spring Harb Symp Quant Biol
1995;60:663-668
3 Gil A, Sharp PA,
Jamison SF, Garcia-Blanco MA. Characterization of cDNAs encoding the
polypyrimidine tract-binding
protein. Genes Dev 1991;5:1224-1236
4 Patton JG, Mayer
SA, Tempst P, Nadal-Ginard B. Characterization and molecular cloning of
polypyrimidine tract-binding
protein: a component of a complex necessary
for pre-mRNA splicing. Genes Dev 1991;5:1237-1251
5 Ghetti A, Pinol-Roma
S, Michael WM, Morandi C, Dreyfuss G. hnRNP I, the polypyrimidine
tract-binding protein: distinct
nuclear localization and association with
hnRNAs. Nucleic Acids Res 1992;20:3671-3678
6 Oh YL, Hahm B,
Kim YK, Lee HK, Lee JW, Song O, Tsukiyama-Kohara K, Kohara M, Nomoto A,
Jang SK. Determination of
functional domains in polypyrimidine-tract-binding
protein. Biochem J 1998;331:169-175
7 Fields S, Song O.
A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature
1989;340:245-246
8 Brunel F, Zakin
MM, Buc H, Buckle M. The polypyrimidine tract binding (PTB) protein
interacts with single-stranded DNA in
a sequence-specific manner. Nucleic Acids
Res 1996;24:1608-1615
9 Wagner EJ,
Garcia-Blanco MA. Polypyrimidine tract binding protein antagonizes exon
definition. Mol Cell Biol
2001;21:3281-32888
10 Moreira A, Takagaki Y,
Brackenridge S, Wollerton M, Manley JL, Proudfoot NJ. The upstream
sequence element of the
C2 complement poly(A) signal activates mRNA
3 end formation by two distinct mechanisms. Genes Dev
1998;12:2522-2534
11
Lou H, Helfman DM, Gagel RF,
Berget SM. Polypyrimidine tract-binding protein positively regulates
inclusion of an
alternative 3-terminal exon. Mol Cell Biol
1999;19:78-85
12 Lin CH, Patton JG.
Regulation of alternative 3 splice site selection by constitutive splicing
factors. RNA 1995;1:234-245
13 Singh R, Valcarcel J, Green
MR. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic
polypyrimidine tract-
binding proteins. Science
1995;268:1173-1176
14 Witherell GW, Gil A, Wimmer
E. Interaction of polypyrimidine tract binding protein with the
encephalomyocarditis virus
mRNA internal ribosomal entry site.
Biochemistry 1993;32:8268-8275
15 Choo QL, Kuo G, Weiner AJ,
Overby LR, Bradley DW, Houghton M. Isolation of a cDNA clone derived from
a blood-borne
non-A, non-B viral hepatitis genome.
Science 1989;244:359-362
16
Lin C, Lindenbach BD, Pragai
BM, McCourt DW, Rice CM.Processing in the hepatitis C virus E2-NS2 region:
identification
of p7 and two distinct E2-specific products
with different C termini. J Virol 1994;68:5063-5073
17 成军,
杨守纯. 现代肝炎病毒分子生物学.
第1版.
北京: 人民军医出版社,
1999:44-73
18 Bukh J, Purcell RH, Miller
RH. Sequence analysis of the core gene of 14 hepatitis C virus genotypes.
Proc Natl Acad Sci
USA 1994;91:8239-8243
19 Kolykhalov AA, Feinstone SM,
Rice CM. Identification of a highly conserved sequence element at the 3'
terminus of
hepatitis C virus genome RNA. J Virol
1996;70:3363-3371
20 Tanaka T, Kato N, Cho MJ,
Sugiyama K, Shimotohno K. Structure of the 3 terminus of the hepatitis C
virus genome. J
Virol 1996;70:3307-3312
21 Ito T, Lai MM. Determination
of the secondary structure of and cellular protein binding to the
3-untranslated region of
the hepatitis C virus RNA genome. J Virol
1997;71:8698-8706
22 Tsuchihara K, Tanaka T,
Hijikata M, Kuge S, Toyoda H, Nomoto A, Yamamoto N, Shimotohno K. Specific
interaction of
polypyrimidine tract-binding protein with
the extreme 3-terminal structure of the hepatitis C virus genome, the 3 X.
J
Virol
1997;71:6720-6726
23 Chung RT, Kaplan LM.
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein I (hnRNP-I/PTB) selectively binds
the conserved 3
terminus of hepatitis C viral RNA. Biochem
Biophys Res Commun 1999;254:351-362
24
Ito T, Tahara SM, Lai MM.
The 3 -untranslated region of hepatitis C virus RNA enhances translation
from an internal
ribosomal entry site. J Virol
1998;72:8789-8796
25 Smith DB, Mellor J, Jarvis
LM, Davidson F, Kolberg J, Urdea M, Yap PL, Simmonds P. Variation of the
hepatitis C virus 5
non-coding region: implications for
secondary structure, virus detection and typing. J Gen Virol
1995;76:1749-1761
26 Tsukiyama-Kohara K, Iizuka
N, Kohara M, Nomoto A. Internal ribosome entry site within hepatitis C
virus RNA. J Virol
1992;66:1476-1483
27
Wang C, Sarnow P, Siddiqui
A. Translation of human hepatitis C virus RNA in cultured cells is
mediated by an internal
ribosome-binding mechanism. J Virol
1993;67:3338-3344
28 Jackson RJ, Howell
MT, Kaminski A. The novel mechanism of initiation of picornavirus RNA
translation. Trends Biochem
Sci 1990;15:477-483
29 Li N, Siddiqui A.
Interaction of polypyrimidine tract-binding protein with the 5 noncoding
region of the hepatitis C virus
RNA genome and its functional requirement
in internal initiation of translation. J Virol
1995;69:6367-6375
30 Elsham GJ, Sonenberg N.
RNA-protein interactions in regulation of picornavirus RNA translation.
Microbiol Rev
1996;60:499-511
31 Hellen CU, Pestova TV,
Litterst M, Wimmer E. The cellular polypeptide p57 (pyrimidine
tract-binding protein) binds to
multiple sites in the poliovirus 5'
nontranslated region. J Virol 1994;68:941-950
32 Hellen CU, Witherell GW,
Schmid M, Shin SH, Pestova TV, Gil A, Wimmer E. A cytoplasmic 57-kDa
protein that is
required for translation of picornavirus
RNA by internal ribosomal entry is identical to the nuclear pyrimidine
tract-
binding protein. Proc Natl Acad Sci USA
1993;90:7642-7646
33 Witherell GW, Schultz-Witherell
CS, Wimmer E. Cis-acting elements of the encephalomyocarditis virus
internal ribosomal
entry site. Virology
1995;214:660-663
34 Witherell GW, Wimmer E.
Encephalomyocarditis virus internal ribosomal entry site RNA-protein
interactions. J Virol
1994;68:3183-3192
35 Buratti E, Gerotto M,
Pontisso P, Alberti A, Tisminetzky SG, Baralle FE. In vivo translational
efficiency of different hepatitis
C virus 5-NTRs. FEBS Lett
1997;411:275-280
36 Collier AJ, Tang S, Elliott
RM. Translation efficiencies of the 5 untranslated region from
representatives of the six major
genotypes of hepatitis C virus using a
novel bicistronic reporter assay system. J Gen Virol 1998;79:2359-2366
37 Kamoshita N,
Tsukiyama-Kohara K, Kohara M, Nomoto A.Genetic analysis of internal
ribosomal entry site on hepatitis C
virus RNA: implication for involvement of
the highly ordered structure and cell type-specific transacting factors.
Virology
1997;233:9-18
38 Ito T, Lai MM. An internal
polypyrimidine-tract-binding protein-binding site in the hepatitis C virus
RNA attenuates
translation, which is relieved by the
3-untranslated sequence. Virology 1999;254:288-296
39 Gosert R, Chang KH,
Rijnbrand R, Yi M, Sangar DV, Lemon SM. Transient expression of cellular
polypyrimidine-tract
binding protein stimulates cap-independent
translation directed by both picornaviral and flaviviral internal
ribosome
entry sites in vivo. Mol Cell Biol
2000;20:1583-1595
40 Reynolds JE, Kaminski A,
Kettinen HJ, Grace K, Clarke BE, Carroll AR, Rowlands DJ, Jackson RJ.
Unique features of
internal initiation of hepatitis C virus
RNA translation. EMBO J 1995;14:6010-6020
41
Rijnbrand R, Bredenbeek P,
van der Straaten T, Whetter L, Inchauspe G, Lemon S, Spaan W. Almost the
entire 5
non-translated region of hepatitis C virus
is required for cap-independent translation. FEBS Lett
1995;365:115-119
| |
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