⊙•病毒性肝炎 VIRAL LIVER DISEASES•⊙

乙肝病毒核心抗原单链抗体细胞内免疫抗乙肝病毒基因治疗研究

陆荫英，王 琳，刘 妍，于 敏，李 克，王业东， 张玲霞，成 军

陆荫英，王琳，刘妍，李克，王业东，张玲霞，成军,中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心，
全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039 
于敏,北京大学第一医院感染病科 北京市 100034
国家自然科学基金攻关项目, No.C03011402,军队“十、五”科技攻关面上项目, No.01MB135
项目负责人 成军，中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京市 100039.  cj@genetherapy.com.cn
电话：010-66933392   传真：010-63801283
收稿日期 2002-03-29   接受日期 2002-05-21

Inhibitory effect of HBcAg ScFv on hepatitis B virus

Yin-Ying Lu,Lin Wang,Yan Liu,Min Yu,Ke Li,Ye-Dong Wang, Ling-Xia Zhang, Jun Cheng Yin-Ying Lu,Lin Wang,Yan Liu,Ke Li,  Ye-Dong Wang, Ling-Xia Zhang, Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China
Min Yu,Department of Infectious Diseases, The First Hospital of Beijing Unversity, beijing, 100034.
Supported by the Natural Science Foundation of China, No . C03011402.
Correstpondence to: Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China.   cj@genetherapy.com.cn
Received  2002-03-29   Accepted  2002-05-21

Abstract
AIM: Single chain fragment variable (ScFv) antibody was the smallest fragment of antibody containing antigen binding domain, which could come into cell easily and had less immunogenicity. In order to study the inhibitory effect on hepatitis B virus of HBcAg ScFv, HBcAg ScFv gene was transferred and expressed in 2.2.15 cell. Meanwhile, the inhibition of HBsAg and HBeAg was investigated.

METHODS:  HBcAg ScFv gene was screened and identified from a semi-synthetic phage library by phage display technique and amplified and cloned into the retroviral vector pLXSN. The reconstructed plasmid pLXSN-HBcAg ScFv was transfected into PA317 cells and infected 2.2.15 cells by using the supernatant containing the pseudovirus. Then, HBsAg and HBeAg were detected by ELISA and the density of HBV DNA was tested by quantitative determination.

RESULTS:  The specific HBcAg ScFv was screened by phage display technique. Then it was amplified and cloned into retroviral vector pLXSN, and transfected into PA317 cell. HBcAg ScFv pseudovirus contained in the supernatant of transfected PA317 cells were identified by RT-PCR. When the HBcAg ScFv pseudovirus were infected into 2.2.15 cells and incubated for 3, 5, 7, 14 days, the P/N value of HBsAg and HBeAg were decreased gradually and turned to negative at day 14. The density of HBV DNA had not changed apparently.

CONCLUSIONS:  The results indicated that HBcAg ScFv gene expressed in 2.2.15 cells can inhibit the expression of HBV significantly and it may be a potential candidate for gene therapy against HBV infection.

Lu YY, Wang L, Liu Y, Yu M, Li K, Wang YD, Zhang LX, Cheng J. Inhibitory effect of HBcAg ScFv on hepatitis B virus. Shijie Huanren Xiaohua Zazhi  2002;10(7):765-769


摘要
目的: 研究乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)人源单链抗体(ScFv)细胞内免疫抗乙型肝炎病毒(HBV)基因治疗的作用.

方法: 用噬菌体表面展示技术筛选特异性的HBcAg人源可变区单链抗体，聚合酶链反应(PCR)法和基因重组技术体外扩增HBcAg单链抗体基因，并构建表达HBcAg ScFv基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-HBcAg，转染PA317细胞，逆转录PCR(RT-PCR)方法验证细胞培养液上清分泌的假病毒颗粒中HBcAg ScFv的表达；将假病毒颗粒感染2.2.15细胞，酶联免疫吸附法(ELISA)检测其上清HBsAg 和HBeAg，定量检测HBV DNA.

结果: 成功筛选出HBcAg ScFv，PCR扩增出750bp的全基因，构建HBcAg ScFv基因的逆转录病毒载体，转染PA317细胞，在上清中检测出含HBcAg ScFv假病毒颗粒的存在，上清感染2.2.15细胞后第3、5、7、14天，HBsAg、HBeAg逐渐下降，到14d时HBsAg已变为阴性，DNA定量检测无明显变化.

结论: HBcAg ScFv能成功地在逆转录病毒载体中表达，并有抑制HBsAg、HBeAg表达的作用.

陆荫英，王琳，刘妍，于敏，李克，王业东， 张玲霞，成军.乙肝病毒核心抗原单链抗体细胞内免疫抗乙肝病毒基因治疗研究. 世界华人消化杂志 2002；10(7)：765-769

0  引言
乙型肝炎病毒(HBV)感染，不仅可引起急、慢性肝炎，还与肝硬化和原发性肝癌的发生、发展有着密切的关系^[1-5].目前对HBV感染缺乏理想的治疗手段，即使是干扰素这类公认有确切疗效的药物，也只有20-40%的持久有效率，探索新的更有效的抗HBV的治疗方法，已成为当前医学研究的热点^[6-10].近年来新发展起来的噬菌体抗体库筛选技术，能不经过人体免疫直接获得人源化抗体，在新型抗病毒药物筛选方面具有强大的发展潜力^[11-13].本实验通过噬菌体抗体库筛选技术筛选得到特异性的HBcAg ScFv,并进一步用转基因方法研究筛选出的HBcAg ScFv在细胞内的表达情况，证实其有抑制HBsAg和HBeAg的作用，有望成为新的抗HBV药物.


1 材料和方法
1.1 材料 乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原蛋白购于Virostat公司；大肠杆菌DH5α、人噬菌体抗体文库，M13K07辅助噬菌体购于Pharmacia公司；Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、SfiI, NotI, EcoRI和XhoI购于Takara生物公司;DNA玻璃奶回收试剂盒、Wizard质粒DNA提取纯化试剂盒、RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、IPTG、X-β-Gal及pGEM-T载体购于Promega公司；PA317细胞、2.2.15细胞购于中国科学院上海细胞生物所；精制胎牛血清、Lipofectin ²⁰⁰⁰转染试剂盒、DMEM培养基、二甲亚枫（DMSO）、G418购于Gibco公司；HBsAg、HBeAg酶联免疫试剂盒购于厦门新创生物技术有限公司；引物合成及DNA测序由上海博亚生物技术有限公司完成；其他生化试剂购自Sigma公司.
1.2 方法 HBcAg ScFv的筛选及表达采用噬菌体表面展示技术，以重组的HBV核心蛋白为包被抗原，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“黏附-洗脱-扩增”筛选过程，获得抗原结合活性较强的乙型肝炎病毒核心蛋白人源单链可变区抗体ScFv片段克隆，并对其进行DNA序列及免疫活性测定.从噬菌体抗体阳性克隆中提取插入了ScFv片段的pHEN1载体质粒转化大肠杆菌HB2151，IPTG诱导表达乙型肝炎核心蛋白可溶性人源单链可变区抗体，ELISA和Western blot检测其抗原结合特异性^[14].HBcAg ScFv基因的扩增及逆转录病毒载体的构建是以上述pHEN1载体中的HBcAg ScFv为模板进行PCR扩增，在编码区的上游和下游分别设计合成一对寡聚核苷酸引物(p1 5’-GAA TTC ATG GCC CAG GTG CAG CTC GT-3’，p2 5’-CTC GAG CTA TGC GGC ACG CGG TTC CA-3’)，引物的3’、5’端分别加入EcoRI和XhoI酶切位点.在0.5mL的Eppendorf管中依次加入17.3μL双蒸水，2.5μL的10×缓冲液（含20mmol·L^-1 MgCl₂）、2μl 2mmol·L^-1 dNTP、1μl 12.5μmmol·L^-1 P1、1μl 12.5μmmol·L-¹ P2、1μl pCP10质粒、0.2μl Taq DNA聚合酶（5×10⁶U·L^-1）.放入PE9600 PCR仪中扩增.扩增条件：94℃变性90s，58℃退火60s，72℃延伸90s，循环30次后，72℃保温10min.10g·L^-1琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果后切胶玻璃奶回收.上述回收的PCR反应产物与pGEM-T载体按8:1混合，在16℃用T4 DNA连接酶连接过夜，随后转化入用氯化钙法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，在铺有异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)及5-溴-4氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷(X-β-Gal)的氨苄西林琼脂糖平板上进行蓝白菌落筛选，挑取白色菌落用碱裂解法提取质粒DNA进行酶切鉴定及测序，证明HBcAg ScFv基因已被克隆进T载体，送DNA测序鉴定.提取该质粒，与载体pLXSN一同用EcoRI及XhoI酶切，用上述相同的方法连接到pLXSN载体中，转化后接种于氨苄西林琼脂糖平板上筛选阳性菌落，提取质粒DNA，双酶切及PCR鉴定后转染PA317细胞，分别用于5μg的pLX SN-HBcAg ScFv质粒加10μl的Lipofectin ²⁰⁰⁰脂质体，pLXSN质粒5μg和Lipofectin ²⁰⁰⁰脂质体10μl混合后(阴性对照)混合室温孵育20min后加入培养皿中，次日按1:10传代，待细胞贴壁后加G418 380μg/ml并维持浓度培养筛选抗性克隆. 14d时获得两个的阳性细胞克隆，分离并传代培养.分别收集培养液上清，提取总RNA，反转录成cDNA，先用HBcAg ScFv的外引物（p1,p2）94℃ 1min 30s, 58℃50s, 72℃1min 30s，PCR扩增30个循环，然后以扩增产物1μl为模板，用内引物(p3 5’-GGG ATG GAT CAA CGC TGG CA-3’ p4 5’-GCC CCA GTG ATG GTC AAG GA-3’, nt 150-671)PCR扩增30个循环，1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定上清中分泌的假病毒颗粒中含有HBcAg ScFv基因表达产物^[14,15]. 2.2.15细胞以1×10⁶接种于细胞培养瓶中，将7ml的PA317抗性细胞培养上清加入培养液中培养2.2.15细胞，第2天换成完全DMEM培养液培养，以后第3、5、7天换液并收集，第7天传代，至14d再收集一次上清，共4次，-20℃保存待测^[16]. 2.2.15细胞上清HBsAg、HBeAg和HBV DNA的检测采用HBsAg和HBeAg酶联免疫(ELISA)测定试剂盒，P/N值为样品值A×20.HBV DNA用中山医科大学生产的定量PCR检测试剂盒测定，操作均按说明书进行