| 100023 北京市2345信箱 | 世界华人消化杂志
2002年7月15日;10(7):765-769 |
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⊙•病毒性肝炎 VIRAL LIVER DISEASES•⊙
乙肝病毒核心抗原单链抗体细胞内免疫抗乙肝病毒基因治疗研究
陆荫英，王 琳，刘 妍，于 敏，李 克，王业东， 张玲霞，成 军
陆荫英，王琳，刘妍，李克，王业东，张玲霞，成军,中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心，
全军病毒性肝炎防治研究重点实验室
北京市
100039
于敏,北京大学第一医院感染病科
北京市
100034
国家自然科学基金攻关项目,
No.C03011402,军队“十、五”科技攻关面上项目,
No.01MB135
项目负责人
成军，中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京市
100039.
cj@genetherapy.com.cn
电话：010-66933392
传真：010-63801283
收稿日期
2002-03-29
接受日期
2002-05-21
Inhibitory
effect of HBcAg ScFv on hepatitis B virus
Yin-Ying
Lu,Lin Wang,Yan Liu,Min Yu,Ke Li,Ye-Dong Wang,
Ling-Xia Zhang, Jun Cheng
Min Yu,Department of Infectious Diseases, The First Hospital of Beijing
Unversity, beijing, 100034.
Supported
by the
Natural Science Foundation of China, No . C03011402.
Correstpondence
to: Jun
Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302
Hospital of PLA, Beijing 100039, China.
cj@genetherapy.com.cn
Received
2002-03-29
Accepted
2002-05-21
Abstract
AIM: Single chain fragment
variable (ScFv) antibody was the smallest fragment of antibody containing
antigen binding domain, which could come into cell easily and had less
immunogenicity. In order to study the inhibitory effect on hepatitis B virus of
HBcAg ScFv, HBcAg ScFv gene was transferred and expressed in 2.2.15 cell.
Meanwhile, the inhibition of HBsAg and HBeAg was investigated.
METHODS: HBcAg
ScFv gene was screened and identified from a semi-synthetic phage library by
phage display technique and amplified and cloned into the retroviral vector
pLXSN. The reconstructed plasmid pLXSN-HBcAg ScFv was transfected into PA317
cells and infected 2.2.15 cells by using the supernatant containing the
pseudovirus. Then, HBsAg and HBeAg were detected by ELISA and the density of HBV
DNA was tested by quantitative determination.
RESULTS:
The specific HBcAg ScFv was screened by phage display technique. Then it
was amplified and cloned into retroviral vector pLXSN, and transfected into
PA317 cell. HBcAg ScFv pseudovirus contained in the supernatant of transfected
PA317 cells were identified by RT-PCR. When the HBcAg ScFv pseudovirus were
infected into 2.2.15 cells and incubated for 3, 5, 7, 14 days, the P/N value of
HBsAg and HBeAg were decreased gradually and turned to negative at day 14. The
density of HBV DNA had not changed apparently.
CONCLUSIONS:
The results indicated that HBcAg ScFv gene expressed in 2.2.15 cells can
inhibit the expression of HBV significantly and it may be a potential candidate
for gene therapy against HBV infection.
Lu YY, Wang L, Liu Y,
Yu M, Li K, Wang YD, Zhang LX, Cheng J. Inhibitory effect of HBcAg ScFv on
hepatitis B virus. Shijie Huanren Xiaohua Zazhi
2002;10(7):765-769
摘要
目的:
研究乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)人源单链抗体(ScFv)细胞内免疫抗乙型肝炎病毒(HBV)基因治疗的作用.
方法:
用噬菌体表面展示技术筛选特异性的HBcAg人源可变区单链抗体，聚合酶链反应(PCR)法和基因重组技术体外扩增HBcAg单链抗体基因，并构建表达HBcAg
ScFv基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-HBcAg，转染PA317细胞，逆转录PCR(RT-PCR)方法验证细胞培养液上清分泌的假病毒颗粒中HBcAg
ScFv的表达；将假病毒颗粒感染2.2.15细胞，酶联免疫吸附法(ELISA)检测其上清HBsAg
和HBeAg，定量检测HBV
DNA.
结果:
成功筛选出HBcAg
ScFv，PCR扩增出750bp的全基因，构建HBcAg
ScFv基因的逆转录病毒载体，转染PA317细胞，在上清中检测出含HBcAg
ScFv假病毒颗粒的存在，上清感染2.2.15细胞后第3、5、7、14天，HBsAg、HBeAg逐渐下降，到14d时HBsAg已变为阴性，DNA定量检测无明显变化.
结论:
HBcAg ScFv能成功地在逆转录病毒载体中表达，并有抑制HBsAg、HBeAg表达的作用.
陆荫英，王琳，刘妍，于敏，李克，王业东，
张玲霞，成军.乙肝病毒核心抗原单链抗体细胞内免疫抗乙肝病毒基因治疗研究.
世界华人消化杂志
2002；10(7)：765-769
0
引言
乙型肝炎病毒(HBV)感染，不仅可引起急、慢性肝炎，还与肝硬化和原发性肝癌的发生、发展有着密切的关系[1-5].目前对HBV感染缺乏理想的治疗手段，即使是干扰素这类公认有确切疗效的药物，也只有20-40%的持久有效率，探索新的更有效的抗HBV的治疗方法，已成为当前医学研究的热点[6-10].近年来新发展起来的噬菌体抗体库筛选技术，能不经过人体免疫直接获得人源化抗体，在新型抗病毒药物筛选方面具有强大的发展潜力[11-13].本实验通过噬菌体抗体库筛选技术筛选得到特异性的HBcAg
ScFv,并进一步用转基因方法研究筛选出的HBcAg
ScFv在细胞内的表达情况，证实其有抑制HBsAg和HBeAg的作用，有望成为新的抗HBV药物.
1
材料和方法
1.1
材料
乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原蛋白购于Virostat公司；大肠杆菌DH5α、人噬菌体抗体文库，M13K07辅助噬菌体购于Pharmacia公司；Taq
DNA聚合酶、T4
DNA连接酶、SfiI,
NotI, EcoRI和XhoI购于Takara生物公司;DNA玻璃奶回收试剂盒、Wizard质粒DNA提取纯化试剂盒、RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、IPTG、X-β-Gal及pGEM-T载体购于Promega公司；PA317细胞、2.2.15细胞购于中国科学院上海细胞生物所；精制胎牛血清、Lipofectin
2000转染试剂盒、DMEM培养基、二甲亚枫（DMSO）、G418购于Gibco公司；HBsAg、HBeAg酶联免疫试剂盒购于厦门新创生物技术有限公司；引物合成及DNA测序由上海博亚生物技术有限公司完成；其他生化试剂购自Sigma公司.
1.2
方法
HBcAg
ScFv的筛选及表达采用噬菌体表面展示技术，以重组的HBV核心蛋白为包被抗原，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“黏附-洗脱-扩增”筛选过程，获得抗原结合活性较强的乙型肝炎病毒核心蛋白人源单链可变区抗体ScFv片段克隆，并对其进行DNA序列及免疫活性测定.从噬菌体抗体阳性克隆中提取插入了ScFv片段的pHEN1载体质粒转化大肠杆菌HB2151，IPTG诱导表达乙型肝炎核心蛋白可溶性人源单链可变区抗体，ELISA和Western
blot检测其抗原结合特异性[14].HBcAg
ScFv基因的扩增及逆转录病毒载体的构建是以上述pHEN1载体中的HBcAg
ScFv为模板进行PCR扩增，在编码区的上游和下游分别设计合成一对寡聚核苷酸引物(p1
5’-GAA
TTC ATG GCC CAG GTG CAG CTC GT-3’，p2
5’-CTC
GAG CTA TGC GGC ACG CGG TTC CA-3’)，引物的3’、5’端分别加入EcoRI和XhoI酶切位点.在0.5mL的Eppendorf管中依次加入17.3μL双蒸水，2.5μL的10×缓冲液（含20mmol·L-1
MgCl2）、2μl
2mmol·L-1
dNTP、1μl
12.5μmmol·L-1
P1、1μl
12.5μmmol·L-1
P2、1μl
pCP10质粒、0.2μl
Taq DNA聚合酶（5×106U·L-1）.放入PE9600
PCR仪中扩增.扩增条件：94℃变性90s，58℃退火60s，72℃延伸90s，循环30次后，72℃保温10min.10g·L-1琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果后切胶玻璃奶回收.上述回收的PCR反应产物与pGEM-T载体按8:1混合，在16℃用T4
DNA连接酶连接过夜，随后转化入用氯化钙法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，在铺有异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)及5-溴-4氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷(X-β-Gal)的氨苄西林琼脂糖平板上进行蓝白菌落筛选，挑取白色菌落用碱裂解法提取质粒DNA进行酶切鉴定及测序，证明HBcAg
ScFv基因已被克隆进T载体，送DNA测序鉴定.提取该质粒，与载体pLXSN一同用EcoRI及XhoI酶切，用上述相同的方法连接到pLXSN载体中，转化后接种于氨苄西林琼脂糖平板上筛选阳性菌落，提取质粒DNA，双酶切及PCR鉴定后转染PA317细胞，分别用于5μg的pLX
SN-HBcAg
ScFv质粒加10μl的Lipofectin
2000脂质体，pLXSN质粒5μg和Lipofectin
2000脂质体10μl混合后(阴性对照)混合室温孵育20min后加入培养皿中，次日按1:10传代，待细胞贴壁后加G418
380μg/ml并维持浓度培养筛选抗性克隆.
14d时获得两个的阳性细胞克隆，分离并传代培养.分别收集培养液上清，提取总RNA，反转录成cDNA，先用HBcAg
ScFv的外引物（p1,p2）94℃
1min 30s, 58℃50s,
72℃1min
30s，PCR扩增30个循环，然后以扩增产物1μl为模板，用内引物(p3
5’-GGG
ATG GAT CAA CGC TGG CA-3’
p4 5’-GCC
CCA GTG
ATG GTC
AAG GA-3’,
nt 150-671)PCR扩增30个循环，1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定上清中分泌的假病毒颗粒中含有HBcAg
ScFv基因表达产物[14,15].
2.2.15细胞以1×106接种于细胞培养瓶中，将7ml的PA317抗性细胞培养上清加入培养液中培养2.2.15细胞，第2天换成完全DMEM培养液培养，以后第3、5、7天换液并收集，第7天传代，至14d再收集一次上清，共4次，-20℃保存待测[16].
2.2.15细胞上清HBsAg、HBeAg和HBV
DNA的检测采用HBsAg和HBeAg酶联免疫(ELISA)测定试剂盒，P/N值为样品值A×20.HBV
DNA用中山医科大学生产的定量PCR检测试剂盒测定，操作均按说明书进行.
2
结果
2.1
HBcAg ScFv的筛选
用噬菌体抗体展示技术成功筛选出HBcAg
ScFv，经SDS-PAGE电泳表明，HB2151中表达的HBcAg可溶性ScFv分子量约28000，免疫活性检测结果表明，该抗体具有较强的抗原结合活性和特异性[17].
2.2
人源HBcAg
ScFv逆转录病毒载体的构建及其转移和表达
用PCR方法，在HBcAg
ScFv两端设计引物从pHEN1-HBcAg
ScFv载体上扩增出其全基因片段750bp，然后分别用EcoRI和XhoI双酶切扩增产物及逆转录病毒载体pLXSN，T4
DNA连接酶连接，即构建成表达HBcAg
ScFv基因的逆转录病毒载体(pLXSN-HBcAg
ScFv)(图1).用EcoRI和XhoI双酶切鉴定，证实连接正确(图2).用Lipofectin
2000转染PA317细胞，G418筛选，选出两株抗性细胞克隆，用巢式RT-PCR两次扩增出内引物所包含的457bp片段，证明抗性细胞分泌上清的假病毒颗粒中有HBcAg
ScFv的表达(图3).
图1
(PDF) HBcAg ScFv基因的逆转录病毒载体(pLXSN-HBcAg
ScFv）
1.DNAmarker
2. 3. 实验组
图2
(PDF) HBcAg ScFv EcoRI和XhoI双酶切图
1.DNAmarker
2. 3. 实验组
图3
(PDF)
转染PA317细胞上清巢式RT-PCR扩增图
2.3
人源HBcAg
ScFv基因对HBV抗原表达及HBV
DNA的影响
转染pLXSN空载体的抗性细胞上清感染的2.2.15细胞培养上清为阴性组.两株抗性细胞克隆上清感染2.2.15细胞的第3、5、7、14天的上清中HBcAg的P/N值分别为组1:1.72、1.80、1.26、2.1；组2:1.96、2.52、2.96、1.9；在第14天时两组均为阴性(<2.1）；阴性组为1.04、2.56、1.98、3.78.第3、5、7、14天的上清中HBeAg的P/N值分别为组1:7.32、30.50、37.12、14.92；组2:7.72、24.68、21.52、12.84；阴性组为10.24、26.76、39.04、34.38.实验组中HBcAg和HBeAg的表达较对照组明显下降.HBV
DNA第7、14天时，实验组1分别为7.96×106，1.13×106；实验组2分别为6.75×106，6.26×106；阴性组为9.8×106，6.83×106(图4、5).
图4 (PDF)
HBcAg ScFv对2.2.1细胞分泌HBcAg的抑制
图5 (PDF)
HBcAg ScFv对2.2.1细胞分泌HBeAg的抑制
3
讨论
在众多有潜在应用价值的新型抗病毒治疗策略中，抗病毒基因治疗技术逐渐引起人们的关注[18-24].将特异性抗体以基因转移手段导入体内，通过调节机体免疫应答达到抗病毒感染的目的[25,26]是抗病毒基因治疗领域中一项新兴的技术.在抗体研制发展的三个阶段中，第一代多克隆抗体因成分复杂，针对性差，不宜用于治疗；第二代单克隆抗体虽在抗HBV、HCV感染中的应用研究取得了很大的进展，但存在异源蛋白反应的缺点，很难在临床上推广应用；第三代单链可变区抗体是具有抗原结合位点的最小抗体片段，由连接肽将抗体的重链可变区和轻链可变区连接起来而组成，其分子小，没有Fc段，免疫原性小，易于穿过组织细胞，能通过基因工程技术大量制备，已开始在抗体研究领域崭露头角[27-30].
在乙型肝炎病毒的生活周期中，HBcAg、病毒mRNA和DNA聚合酶共同构成核心颗粒，在核心颗粒中完成病毒DNA的合成.HBcAg具有保护病毒mRNA，防止其被RNA酶降解的作用，HBcAg对于乙肝病毒前基因组RNA的装配、基因组DNA的合成具有重要的作用[31-33].如能将编码HBcAg单链抗体的基因转移到细胞内部，在细胞内与HBcAg结合，则有望阻断病毒的复制过程，从而为抗乙肝病毒治疗开辟新的途径[34].目前靶向HBc的抗体研究已得到广泛重视，但通过杂交瘤技术生产的单克隆抗体的鼠源性问题限制了临床上的应用，因此制备人源化的乙型肝炎病毒核心蛋白抗体是其解决的途径之一.我们应用噬菌体抗体库技术,以HBcAg为固相抗原，从噬菌体单链可变区半合成抗体库中获得了特异性较强的HBcAg人源单链可变区抗体克隆，并对其细胞内免疫的抗病毒作用做了深入的研究.细胞内免疫指将抑制病毒复制和表达的基因导入细胞内进行表达，从而对其中已感染的病毒起抑制或阻断作用，或使细胞对病毒感染具有抵抗力.以单链抗体为主要技术路线的细胞内免疫的主要目的是在哺乳动物细胞内生成特定的单链抗体，并通过其特异性的功能作用干扰细胞功能或阻止病毒的复制.
逆转录病毒表达载体-包装细胞系这一基因转移系统，是目前较为常见的基因转移系统，具有可插入片段长，基因转移效率高，宿主范围广，能稳定表达目的基因的优点.我们用该系统研究人源HBcAg
ScFv转基因表达，在转染的PA317细胞上清中，巢式逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)扩增出HBcAg
ScFv基因，说明HBcAg
ScFv在PA317细胞中稳定表达，并被包装分泌入上清中.我们进一步将PA317细胞上清中分泌的假病毒颗粒感染2.2.15细胞，通过检测被感染细胞培养上清中HBSAg、HBeAg的含量，观察HBcAg
ScFv的细胞内抗病毒作用.以转染pLXSN-HBcAg
ScFv的抗性细胞上清感染的2.2.15细胞培养上清为实验组，以转染pLXSN空载体的相同细胞上清为对照组，研究发现，HBcAg
ScFv能明显抑制2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的水平，抑制作用随着孵育时间的延长而增强，说明HBcAg
ScFv能在胞内抑制HBV的表达，阻断病毒对细胞的损害作用.以上结果证明HBcAg
ScFv可以通过细胞内免疫机制抗HBV感染，效果确切，可以进一步做动物实验研究，如果效果满意将为其用于临床病毒性肝炎的治疗奠定良好基础，在抗HBV感染治疗方面开辟新的道路.
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