P.O.Box 2345, Beijing 100023,China 世界华人消化杂志  2002年6月15日;10(6):642-645
Email: wcjd@public.bta.net.cn 世界华人消化杂志  ISSN 1009-3079  CN  14-1260/R
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⊙病毒性肝炎 VIRAL LIVER DISEASES⊙

HBV转基因小鼠免疫耐受机制的实验研究

熊一力,刘光泽,贾彦征

熊一力，刘光泽，贾彦征，中国人民解放军第458医院全军传染病中心  广州市 510602
熊一力，女，1954-04-18生，四川省通江县人，汉族，1997年博士后第二站出站，主任医师，主要从事慢性乙型肝炎治疗及转基因动物模型制备研究.
项目负责人  熊一力, 510602，广州市东风东路801号，中国人民解放军第458医院全军传染病中心.  xyili@163.net
电话: 020-87373156
收稿日期  2002-01-11  接受日期  2002-03-05


Mechanism of immune tolerance with chronic hepatitis B virus infection in hepatitis B virus transgenic mice

Yi-Li Xiong, Guang-Ze Liu, Yan-Zheng Jia

Yi-Li Xiong, Guang-Ze Liu, Yan-Zheng Jia，PLA Infection Disease Center, Guangzhou 510602，Guangdong  Province, China
Correspondence to: Yi-Li Xiong, PLA Infection Disease Center, 801 Dongfeng East Road, Gangzhou 510602, China.  Xyili@163.net
Received  2002-01-11  Accepted  2002-03-05

Abstract
AIM:To investigate the antigen-presenting function of dendritic cell (DC), the immune states of T lymphocytes (TC) and hepatocytes (HC) in hepatitis B virus (HBV) transgenic mice (HBV-Tg) as an animal model of chronic HBV infection, and to probe into the mechanism of immune tolerance.

METHODS:Expression levels of spleen DC, TC and HC surface molecules, the proliferation response to HBsAg stimulation and the amounts of cytokines on TC in HBV-Tg were measured by flow cytometry,3H-thymidine incorporation, enzyme linked immunoabsorbent assay and immunohistochemistry, respectively.

RESULTS:Expression rates of MHC-Ⅱ, CD80 on DC surface and MHC-I on HC in HBV-Tg were markedly decreased, compared to that in control. The ability of DC to induce TC proliferation was significantly lower and level of mIFN-γ,mIL-2,mIL-6,mIL-10 in the supernatant of TC also decreased in HBV-Tg compared to that in control.

CONCLUSION:In HBV-Tg, the antigen-presenting function of DC to HBV is lower and immune activity of TC is inhibited with a weak immunological response of HC, in which a key issue is the impaired capacity of DC.

Xiong YL,Liu GZ,Jia YZ.Mechanism of immune tolerance with chronic hepatitis B virus infection in hepatitis B virus transgenic mice.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2002;10(6):642-645


摘要
目的:观察乙型肝炎病毒（HBV）转基因小鼠（Tg鼠）树突状细胞（DC）抗原递呈功能，T淋巴细胞（TC）免疫活化状态和肝细胞（HC）的应答能力，探讨慢性HBV感染免疫耐受形成的机制.

方法:用流式细胞术，氚—胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法，ELISA和免疫组织化学方法，分别测Tg鼠脾DC，TC和HC表面分子，HBsAg刺激淋巴细胞增生反应以及TC产生的细胞因子含量.

结果:Tg鼠DC表面MHC-Ⅱ类分子和CD80表达低下，DC诱导脾淋巴细胞对HBsAg刺激的增生反应减弱，TC分泌的mIFN-γ，mIL-2，mIL-6，mIL-10均显著减少，HC膜MHC-I类分子表达量也降低.

结论:Tg鼠DC的HBV抗原递呈功能低下，TC免疫活化受到抑制，HC的应答能力减弱，其中DC功能低下起关键作用.

熊一力,刘光泽,贾彦征.HBV转基因小鼠免疫耐受机制的实验研究.世界华人消化杂志 2002;10(6): 642-645


0  引言
乙型肝炎病毒（HBV）感染慢性化的机制之一是宿主对HBV产生不同程度的免疫耐受.HBV转基因小鼠（Tg鼠）与之类似，对HBV抗原也不产生体液和细胞免疫应答，处于免疫耐受状态，因而是研究人慢性HBV感染免疫耐受形成机制最理想的动物模型［1-5］.对HBV的免疫耐受形成涉及哪些因素？打破免疫耐受应针对哪一环节？至今还不够明确.我们对Tg鼠树突状细胞（DC）抗原提呈功能，T淋巴细胞（TC）免疫活化状态和肝细胞（HC）应答能力的研究，来探讨慢性HBV感染免疫耐受的机制，以寻求打破免疫耐受和防治慢性HBV感染的途径.

1  材料和方法
1.1  材料  Tg鼠由本室通过原核显微注射1.3 copy HBV全基因制备［6].非转基因小鼠（非Tg鼠）为对照组.所有小鼠均系6～8周龄BALB/C鼠，体质量16～18g.Ia-FITC，CD80-FITC（英国Serotec公司产品）；CD8-FITC，CD28-PE，MHC-Ⅰ类mAb H-2Dd（美国Southen Biotechnolagy公司产品）；HBsAg（康泰生物制品公司产品）；mIFN-γ,mIL-2,mIL-6,mIL-10检测试剂盒（购自晶美生物工程有限公司）；［3H］-TdR（购自北京原子能研究所）；液体闪烁计数仪（Beckman LS）；流式细胞仪（Becton Dickinson）.
1.2  方法  取Tg鼠和非Tg鼠各12只.按改良Sterinman法［7]分离脾脏DC和淋巴细胞，采用间接免疫荧光法，分别加FITC或PE标记的Ia，CD80，CD8和CD28后，通过流式细胞仪分析Tg鼠和非Tg鼠DC表面Ia，CD80和TC表面CD8；CD28占总细胞百分率.取HBsAg免疫的Tg鼠和非Tg鼠各12只的脾淋巴细胞悬液5×105/ml，同时加10ug/mlHBsAg后，分别以200ul/孔接种于96孔培养板，37℃，50ml/L CO2，培养72h.收样前6h加入3H-TdR18.5×108 Bq/L.收样后用液闪仪测3H-TdR掺入量，得出HBsAg刺激后两组鼠淋巴细胞增生的结果.另取Tg鼠和非Tg鼠各12只，分离脾DC和淋巴细胞.先将新分离的DC细胞悬液与10ug/ml HBsAg，37℃共育1h后洗涤，以103/孔加入96孔培养板与5×105/孔的淋巴细胞共同培养.培养的条件、时间及3H-TdR掺入量检测均同上.最后得出两组鼠DC诱导HBsAg刺激两组鼠淋巴细胞增生不同组合的4组淋巴细胞增生结果.收集HBsAg刺激淋巴细胞增生试验中，经HBsAg刺激后48h淋巴细胞的培养上清，按mIFN-γ,mIL-2,mIL-6,mIL-10检测试剂盒说明书，用ELISA方法检测.取Tg蠛头荰g鼠各8只，取肝组织冰冻切片，用MHC-I类分子单抗H-2Dd标记显色后，用免疫组织化学法检测.

2  结果
2.1  Tg鼠DC的抗原提呈功能  Tg鼠DC表面Ia（相当于人的MHC-Ⅱ类分子）和CD80占总细胞数的百分率显著低于非Tg鼠（表1）.现已知DC加工的抗原片段与MHC-Ⅱ类分子结合后，才能实现抗原提呈,DC表面分化抗原CD80是抗原递呈过程的协同刺激因子，如果DC的MHC-Ⅱ和CD80表达量低下，势必影响DC的抗原提呈功能［8，9] .Tg鼠的DC明显不能有效地刺激Tg鼠和非Tg鼠淋巴细胞对HBsAg的免疫应答，出现淋巴细胞增生的显著降低.而用非Tg鼠的DC可明显提高Tg淋巴细胞对HBsAg的应答（表2）.表明，Tg鼠的DC对HBV抗原的提呈功能低下.
2.2  Tg鼠TC的免疫活化状态  Tg鼠TC CD8和CD28表达量与非Tg鼠之间差异无显著意义.TC上的CD8是MHC-Ⅰ类分子的受体.CD28是接受DC上协同刺激因子的受体，如TC