100023 北京市2345信箱 世界华人消化杂志  2002年2月15日;10(2):137-140
Email: wcjd@public.bta.net.cn 世界华人消化杂志  ISSN 1009-3079  CN  14-1260/R
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⊙病毒性肝炎⊙

乙型肝炎病毒HBsAg重组疫苗与表面抗原DNA疫苗诱导H-2b小鼠免疫应答 的实验研究

洪  源,成  军,董  菁,李  克,王  琳,王  刚,刘  妍

洪源，成军，董菁，李克，王琳，王刚，刘妍，中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心  北京市 100039
洪源，男，1974-12-2生，医学硕士，医师，主要从事传染病的临床治疗与研究工作.
项目负责人  成军，100039，北京市丰台路26号，中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心.  cj@genetherapy.com.cn
电话:010-66933391  传真：010-63801283
收稿日期  2001-09-25  接受日期  2001-10-20


Experimental study on the immune responses in H-2b mice immunized by  recombinant HBsAg vaccine and DNA vaccines of HBV large, middle and major envel ope genes

Yuan Hong, Jun Cheng, Jing Dong, Ke Li, Ling Wang, Gang Wang，Yan Liu

Yuan Hong, Jun Cheng, Jing Dong, Ke Li, Ling Wang, Gang Wang, Yan Li u, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospi tal of PLA, Beijing 100039, China
Correspondence to: Prof. Jun Cheng,Gene Therapy Research Center,  Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, Chin a.  cj@genetherapy.com.cn
Received  2001-09-25  Accepted  2001-10-20


Abstract
AIM:To observe the immune responses in H-2b mice immunized by recombinant HBsAg vaccine and DNA vaccines of HBV large, middle and major envelope genes.

METHODS:The DNA vaccines, pVR1012-L, pVR1012-M and pVR1012-S, were constructed by inserting HBV envelope gene fragments into plasmid pVR1012. The expression of them in COS7 cell line was examined by Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method. And 50 C57BL/6 mice were divided into 5 groups, immunized with 100μg plasmid pVR1012-L, pVR1012-M, pVR1012-S, pVR1012 and 1μg recombinant HBsAg vaccine, respectively. Anti-HBs in mice sera was detected with ELISA.

RESULTS:Expression of HBsAg was confirmed by ELISA in COS7 cells transfected with pVR1012-L, pVR1012-M and pVR1012-S. Anti-HBs were positive after first inoculation in recombinant HBsAg vaccine group, but it was not detected in DNA vaccine groups. Moreover, the titers of serum anti-HBs were similar in recombinant HBsAg vaccine group as in DNA vaccine groups later.

CONCLUSION:In this experiment the DNA vaccines show antigenecity in humoral immunity.

Hong Y, Cheng J, Dong J, Li K, Wang L, Wang G, Liu Y. Experimental study on the immune responses in H-2b mice immunized by recombinant HBsAg vaccine and DNA vaccines of HBV envelope genes.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2002;10(2):137-140


摘要
目的:观察重组乙肝疫苗及乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原DNA疫苗接种后，C57BL/6（H-2b）小鼠的免疫应答.

方法:构建质粒pVR1012-L，pVR1012-M，pVR1012-S. 转染COS7细胞系进行表达. 将C57BL/6小鼠分为5组，分别接种质粒pVR1012-L，pVR1012-M，pVR1012-S，pVR1012 100μg及重组乙肝疫苗1μg. ELISA法检测小鼠血清抗-HBs.

结果:DNA疫苗在转染细胞中可表达HBsAg. 血清抗-HBs在第一次接种重组乙肝疫苗后即可检出，而在DNA疫苗组则未检出. 此后重组疫苗组诱导的抗-HBs的滴度与DNA疫苗组相似.

结论:HBV表面抗原DNA疫苗在H-2b小鼠试验中有体液免疫原性.

洪源, 成军, 董菁, 李克, 王琳, 王刚, 刘妍. 乙型肝炎病毒HBsAg重组疫苗与表面抗原DNA疫苗诱导H-2b小鼠免疫应答的实验研究.
世界华人消化杂志 2002;10(2):137-140


0  引言
乙型肝炎病毒（HBV）是慢性肝病的重要病原体［1］，且是引发肝细胞癌（HCC）的 重要因素［2-5］，长期以来威胁我国人民的健康. 针对HBV的治疗方案存在有费用 昂贵、远期疗效差等缺点. DNA疫苗技术［6-9］是90年代初发展起来的一项新兴免 疫技术，其最大的优点是可以通过内源性抗原递呈系统，诱发机体特异性细胞免疫，通过细 胞毒性T淋巴细胞（CTL）攻击携带有特异性抗原的靶细胞，从而达到预防和治疗的目的. 针对HBV的DNA疫苗研究早在1993年就有报道［10］，之后有国内外多家学者［11- 17］报道了HBV DNA疫苗的免疫效果，Tacket et al［18］已进行了HBV DNA疫 苗I期临床实验. 动物实验证明HBV核酸免疫后可诱导特异性的体液、细胞免疫反应.乙型肝 炎病毒表面抗原的编码基因序列中含3个起始密码子（ATG），共用一个终止编码子（TAG） ，分别编码大蛋白（前S1、前S2和S蛋白）、中蛋白（前S2和S蛋白）和主蛋白（S蛋白） . 根据HBsAg的特性，我们构建了以高效真核细胞表达载体pVR1012为载体的，目的基因为表 面抗原大蛋白、中蛋白和主蛋白DNA的重组质粒，并以此系列DNA疫苗接种小鼠，观察免疫应 答情况.

1  材料和方法
1.1  材料  大肠杆菌JM 109，DH 5α及细胞系COS7为本 室保存，质粒pGEM-Teasy购自Promega公司，pVR1012购自Vical公司. Taq聚合酶、琼脂糖 购自Promega公司，dNTP、T4连接酶和RNA酶购自Takara公司，内切酶EcoRI、XhoI 、KpnI、Bgl II、Pst I、Not I、SacI购自Takara公司，脂质体（LipofectAmine）购 自Gibco BRL公司. 玻璃奶DNA回收试剂盒为博大公司产品，HBsAg ELISA检测试剂盒购自Org anon公司，抗-HBs ELISA检测试剂盒购自DiaSorin公司. 热循环仪为PE公司产品，酶联吸附读数仪为Bio-Rad 550型，凝胶成像仪为Alpha Innotech公司产品. C57BL/6纯系小鼠 购自军事医学科学院，雌雄各半，共50只. 按参考文献［25］，设计HBV表面大（L）、中（ M）、主（S）蛋白上游引物，共用一条下游引物， 由赛百盛公司合成. 引物序列如 下：L 上游：5'-GA CTG CAG GCC ATG GGT CTT TTC TGC AGA GC-3'，M上游：5 '-GA CTG CAG GCC ATG CAG TGG AAC TCC ACA AC-3'， S上游：5'-GA CTG CAG ACC CTG CAC CGA ACA TGG AG-3' 下划线部分为Pst I位点；下 游：5'-GT AGA TCT AAG GCA TCA AGG CAG GAT AGC-3'，下划线部分为B gl II位点.
1.2  方法 
1.2.1  质粒的构建及鉴定 以慢性乙肝病人血清中的HBV  DNA为模板，PCR扩增目的基因片段. TA克隆［19，20］到pGEM-Teasy中，测序鉴定 无误后，命名为Teasy-L，Teasy-M，Teasy-S. PstI/BglII双酶切后，回收片段，T4连 接酶连接，转化细菌DH 5α，提取质粒，酶切鉴定连接方向，命名为pVR1012-L，pVR1012 -M，pVR1012-S，测序鉴定正确.
1.2.2  转染COS7细胞系 应用LipofectAmine［21- 24］于无血清RPMI 1640培养基中转染COS7细胞系，孵育6h后换液，正常培养48h. 收集细 胞，PBS缓冲液洗2次，悬浮细胞，立即加入2×SDS凝胶加样缓冲液，冰浴30min，100℃煮沸 10min，12000转/分（rpm）离心，吸取上清，-20℃保存备用. 按照Organon公司ELISA检 测盒的说明，检测细胞裂解液中的HBsAg表达.
1.2.3  免疫小鼠 将50只C57BL/6小鼠分为5组，重组 乙肝疫苗组10只，pVR1012-L组10只，pVR1012-M组10只，pVR1012-S组10只，pVR1012组10只. 应用碱裂解法提取质粒，紫外分光光度计进行核酸定量，将质粒浓度标化为1μg/μl. 免疫方案：免疫前5d，在小鼠双侧胫骨前肌肌肉注射0.25%盐酸布比卡因，每侧50μl；之后每2周注射一次DNA疫苗，每次注射100μl，注射部位为胫骨前肌，多点注射，共免疫3 次.
1.2.4  体液免疫检测 第一次免疫后第0、2、4、6、8周 自小鼠眼眶采血，离心分离血清，-20℃保存，按照DiaSorin公司的说明，统一检测抗-HB s.
统计学处理 采用STATA统计软件，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验.

2  结果
2.1  PCR扩增HBV大蛋白、中蛋白和主蛋白基因结果 大蛋白基因全长1434 bp，中蛋白基因全长1077 bp，主蛋白基因全长922 bp，PCR电泳结果分别见图1. 将PCR产物克隆后送博亚公司测序，结果与发表的HBV DNA（adr亚型）序列［25］比 较，完全一致.

图1 PCR扩增HBV大蛋白（L）、中蛋白（M）和主蛋白（S）编码 序列电泳图

2.2  质粒酶切鉴定结果 将目的基因连接入pVR1012载体 后，酶切鉴定pVR1012-L，pVR1012-M与pVR1012-S，见图2. 送博亚公司测序，结果与发 表的HBV DNA（adr亚型）序列［25］比较，完全一致.

图2 酶切鉴定pVR1012、pVR1012-S、pVR1012-M 、pVR1012-L电泳图其中pVR1012为SacI与KpnI双酶切，pVR1012-S为PstI与BglII双酶切，pVR101 2-M为XhoI酶切，pVR1012-L为PstI与EcoRI双酶切

2.3  质粒转染真核细胞的实验结果 质粒转染COS7细胞 系，细胞裂解液经ELISA方法检测HBsAg的表达，结果见表1.

表1  DNA疫苗转染COS7细胞系HBsAg的ELISA检测结果  （n=10）

质粒 A值 P/N比值
pVR1012 0.068 0.932
pVR1012-S 1.561 >10a
pVR1012-M 1.590 >10a
pVR1012-L 1.366 >10a

aP<0.05, vs pVR1012质粒组

2.4  免疫小鼠效果 小鼠血清中抗-HBs ELISA结果见表 2. 可见重组乙肝疫苗组中，抗-HBs在第一次接种后即可检出，而此时在DNA疫苗组则未检 出. pVR1012-L组中，血清抗-HBs在接种第4周时可检出，滴度呈升高趋势，到第8周时与 重组乙肝疫苗组的抗-HBs水平相似. pVR1012-M组血清中抗-HBs在接种第6周时检出，第8 周时滴度超过了重组乙肝疫苗组的抗-HBs水平. pVR1012-S组血清中抗-HBs仅在接种第4 周时检出.

表2  疫苗免疫后抗-HBs的ELISA检测结果（mIU ml-1, n=10, x±s）

组别 0wk 2wk 4wk 6wk 8wk
HBsAg疫苗 0 46.96±29.20 146.80±149.32 171.73±156.96 145.28±117.15
pVR1012-L 0 0 42.17±26.45a 22.50±2.84a 134.96±176.60a
pVR1012-M 0 0 0 24.0b 169.4a
pVR1012-S 0 0 19.1b 0 0
pVR1012 0 0 0 0 0

aP>0.05，bP<0.05，vs HBsAg疫苗组.


3 讨论
DNA疫苗作为一种新的免疫接种手段，问世不久就在感染性疾病［28-30］及肿瘤［31-35］的防治中显示出巨大的应用潜力. 1993年Davis et al［10］报 道了第一篇HBV DNA疫苗研究，之后的一系列研究［11-17］证明了HBV DNA疫苗的有 效性，现已进行了I期临床试验. 本研究目的是以接近实用为目标，同时比较DNA疫苗与重组 蛋白质疫苗在诱导体液免疫方面的差异.本研究应用的pVR1012载体是Vical公司构建的真核表达载体，最近有学者应用pVR1012载体 进行DNA疫苗研究［36-40］，并取得较好的免疫效果. Kochel et al［36 ］将登革热病毒囊膜基因装载于pVR1012，免疫BALA/c小鼠，检测血清发现可产生中和 抗体；Jiang et al［37］将粗球孢子菌的糖蛋白抗原2（Ag2）cDNA装载于pVR10 12中，核酸免疫BALA/c小鼠后，小鼠可耐受致死剂量的粗球孢子菌的攻击. 上述研究结果 提示pVR1012可作为良好的DNA疫苗载体. 我们选择HBV表面抗原大、中蛋白基因为DNA疫苗的 抗原表达区，是参考Davis et al［10-13］既往的研究成果，因其可有效的增 强HBsAg的表达. 重组质粒经瞬时转染实验，已证实其在COS7细胞系中可表达HBsAg.免疫C57BL/6小鼠后，重组蛋白质疫苗组最早出现特异性体液免疫反应，继而pVR1012-L 组在接种后第4周出现体液免疫反应，pVR1012-M组在接种后第6周出现，pVR1012-S组无明 确体液免疫反应证据. 这说明DNA疫苗诱导抗体反应相对蛋白质疫苗所需的时间长. DNA疫苗 出现抗体反应后滴度上升较快，在接种后第8周，pVR1012-L与pVR1012-M组与蛋白质疫苗 组抗-HBs的滴度t检验无明显差别. 但需要注意的一点是，蛋白质疫苗组小鼠的阳性反 应率为80%（8/10），而pVR1012-L为40%（4/10），pVR1012-M仅为20%（2/10）.
      我们认为对这一问题的全面理解有待于进一步观察.对于pVR1012-L，pVR1012-M与pVR1012-S在诱导抗体反应方面的区别，已有文献报道［10 ］.用S区加上前S2区基因免疫后产生的抗体比单独S区基因免疫产生的抗体早1wk，且抗体滴 度强10倍. 本研究基本证实了这一观点，但到目前为止，pVR1012-S组仍未见抗体的产生. 有待进一步观察后解释.
      总之，我们的工作证实HBV DNA疫苗可诱导正常小鼠产生有保护滴度的抗体，单独应用时可作为有效的预防性疫苗应用，与常规蛋白疫苗相比，在诱导抗体反应方面结果相似. 这一结 果为我们今后进一步研究HBV治疗性DNA疫苗打下了实验基础.

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