⊙临床经验⊙

基因芯片检测拉米夫定治疗慢性乙型肝炎中HBVYMDD变异25例

杨守平，胡德昌，郑可飞，孙小兵，陶维玉，马 宁

杨守平，郑可飞，孙小兵，陶维玉，乐清市第三人民医院肝病科 浙江省乐清市 325604
胡德昌，复旦大学附属中山医院 上海市 200032
马 宁，上海博华基因芯片技术有限公司 上海市 200092
项目负责人 杨守平，325604，浙江省乐清市柳市前街335号，乐清市第三人民医院肝病科
电话：0577-82173689 传真：0577-62782169
收稿日期 2002-05-21 接受日期 2002-07-05


摘要
目的:应用基因芯片新技术检测拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中发生HBVYMDD变异的情况，进一步探讨YMDD变异与临床的关系.

方法:对应用拉米夫定治疗6-19mo的25例ALT异常的慢性乙肝患者进行肝功能、乙肝病毒血清学标志、耐药基因芯片检测，9例患者进行了肝活检肝组织病理学检查.

结果:25例中，HBVDNA阴性4例，21例阳性，其中检出HBVYMDD变异5例,检出率为23.8％,并与用药时间长短有关,6mo,7-12mo，13-19mo变异检出率分别为12.5％、20％和66.7％. HBV-YMDD变异者ALT均大于300U/L.9例病理学报告肝组织内有不同程度的炎症活动和肝纤维化发生，8例肝组织中HBsAg和/或HBcAg阳性.

结论:服用拉米夫定时间越长，HBVYMDD变异检出率越高.对ALT异常的患者应定期随防，若发现ALT水平明显升高时应考虑HBVYMDD变异的可能.血清中HBVDNA转阴并不表明肝组织中HBVDNA也已转阴.基因芯片检测HBVYMDD变异可以多位点同时进行，有较好的重复性和准确性，值得推广.

杨守平，胡德昌，郑可飞，孙小兵，陶维玉，马宁.基因芯片检测拉米夫定治疗慢性乙型肝炎中HBVYMDD变异25例.世界华人消化杂志 2002;10(9):1067-1068


0 引言
在长期应用拉米夫定（lamivudine）治疗慢性乙型肝炎的过程中，容易导致HBVP基因的YMDD基序变异而发生耐药、肝炎复发的问题已引起临床医生的关注.目前，对拉米夫定相关的HBV变异检测方法有多种，各有局限性.我们采用拉米夫定耐药多位点基因芯片新技术，对25例长期应用拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者的血清标本进行了检测，现将结果报告如下.

1 材料和方法
1.1 材料 20例为2001-11/2002-01的到我院肝病专科门诊及住院患者，服用拉米夫定时间均在6mo以上伴ALT异常，其中男21例，女4例.年龄15-48岁，平均年龄28岁.全部病例符合2000-09西安会议修订的《病毒性肝炎防治方案》^[1]中慢性乙型肝炎诊断标准，其中肝活检肝组织病理学诊断证实9例.
1.2 方法 肝功能、HBV血清标志: 25例均常规检测血清肝功能、HBV血清学标志（HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc，酶标法），由本院检验科完成.基因芯片检测：血清标本送上海博华基因芯片技术有限公司研发部，用该公司新开发的拉米夫定耐药多位点基因芯片检测HBVYMDD变异.病理学检查：肝穿刺术为1s负压抽吸法，取肝组织标本15-20mm置于10％甲醛溶液内固定保存，送复旦大学医学院病理教研室进行光镜和免疫组化检查.

2 结果
2.1 HBVYMDD变异检测结果 25例中HBVDNA阴性4例，HBVDNA阳性21例，其中检出YVDD变异＋L528M共生3例，YVDD共生2例，野生株16例.四个常见位点检测结果见表1.
表1 HBVYMDD各位点变异检测结果

2.2 拉米夫定治疗时间与YMDD变异由表2可见有服药时间越长，HBVYMDD变异检出率越高的趋势.

表2 LAM治疗时间与YMDD变异检出率

2.3 ALT与HBVYMDD变异关系 25例血清检测有4例HBVDNA阴性，其ALT水平在120-150U/L之间；在21例HBVDNA阳性者中，未发生变异者ALT水平均在300 U/L以下波动，而发生变异者ALT都大于300U/L（见图1）.

6 12 18 24
拉米夫定服药时间
△变异组 ●未变异 ×HBV DNA阴性组

图1 (PDF)ALT 与HBVYMDD变异的关系

2.4 肝活检患者情况9例肝活检的患者中，血清HBVDNA阴性3例，阳性6例，其中2例发生YMDD变异；病理免疫组化报告肝组织内均检测出HBV标志,其中HBsAg、HBcAg两项阳性4例;光镜检查有不同程度的炎症活动和纤维化发生.

3 讨论
现有的HBVYMDD变异检测方法有多种, 如PCR-RELP、基因测序、线性探针检测，Lihtcycler技术等，而应用多位点基因芯片检测HBVYMDD变异，目前国内报道尚少，本文为该新技术在临床应用的初步报告.
  25份血清标本检测结果表明，应用拉米夫定治疗时间在6mo以上者，HB-VDNA转阴4例，21例依然阳性，检出HBVYMDD变异5例，检出率为23.8％，其中7-12mo和13-19mo变异检出率分别为12.5％、20％和66.7％.由此可见，服药时间越长，HBVYMDD变异发生率越高.本组病例均有不同程度的转氨酶异常.血清HBVDNA检测阴性者，ALT水平在150U/L以下；HBVDNA阳性，未发生HBVYMDD变异者一般ALT在300U/L以下波动，而发生变异的患者ALT水平均超过300U/L.这提示，长期应用拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎时，一定要重视随访，定期检测，若发现ALT水平明显异常时, 应考虑有HBVYMDD变异可能.在9例肝活检病例中，肝组织内有不同程度的炎症活动和肝纤维发生，血清HBV-DNA消失而肝组织内HBV标志检测仍呈阳性，这说明血清HBV-DNA转阴并不表明肝组织内HBV的清除，血清ALT异常者肝组织内确有炎症活动.
  本文应用基因芯片新技术检测结果与作者前期采用的PCR-RELP和基因测序方法检测结果基本一致^[2],说明基因芯片检测HBVMDD变异具有较好的重复性和准确性.基因芯片可以同时进行多位点检测，能发现HBV突变与共生的病例,与其他检测方法相比有明显优势.随着拉米夫定的广泛和长期应用,国内慢性乙肝患者中由此而引起HBVYMDD变异导致耐药、肝炎复发、以致发生病情恶化的问题会更引人关注.因此，临床上迫切需要一种简便、高效、成本较低的方法，对应用LAM治疗的患者进行动态监测，以指导临床合理用药.多位点基因芯片检测技术的开发和应用，期望能够解决这一问题.
   致谢：本文病理学检查得到复旦大学医学院病理教研室胡锡琪教授的大力支持，特此致谢.

4 参考文献
1   中华医学会传染病与寄生虫病分会、肝病学分会，病毒性肝炎防治方案，中华内科杂志 2001;1:62-68
2   郑可飞,杨守平,胡德昌,陈孟峰,黄志贤,胡晚霞.拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中HBVYMDD变异与临床，
   中西医结合肝病杂志2002;1:13-14